赵咏梅,马三平,王乐融

(西安文理学院 生物与环境工程学院，陕西 西安 710065)

高乌头(AconitumsinomontanumNakai)为毛茛科毛茛属植物，药用历史悠久中医常以高乌头根入药，用以治心悸、胃气痛、跌打损伤等症[1]。高乌头中主要含有二萜类生物碱，以C-18 型二萜生物碱高乌甲素居多[2]。高乌甲素化学式C32H44N2O8，分子量584.64，外观白色晶体[3]。

高乌甲素具有较强的镇痛作用，维持时间较长，且无成瘾性，不会发生蓄积中毒，临床常以高乌甲素的氢溴酸盐用于癌症患者轻、中度疼痛的治疗和术后痛的治疗[4～6]。研究证明，腹腔注射或灌胃给予高乌甲素均能明显提高小鼠、大鼠的痛阈，其镇痛强度约是氨基比林的7倍，且强于吲哚美辛和阿司匹林，灌服给药比注射给药药效明显延长[7～8]。在大鼠坐骨神经结扎引起的神经病理性疼痛模型上，腹腔注射4 mg·kg-1高乌甲素即可对模型鼠机械痛和热痛产生显著镇痛作用，并且连续给药3周不产生耐药性[9]。然而高乌甲素用于宠物犬类的报道却并不多。

比格犬又名“米格鲁猎兔犬”，小型猎犬，一般体重7.1～9.1 kg，是目前实验研究中使用最多也是最标准的犬类实验动物，被广泛用于微生物学、病毒学、生物化学、病理学、药理学等各类研究工作中[10]。使用比格犬作为实验动物，探究高乌甲素提取液在药代动力学方面的性质，旨在为高乌甲素在大型实验动物内的临床研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 植物材料与标准品 采自河北的野生高乌头根，取250g左右备用。经西安鸿生生物科技有限公司测定，药材中高乌甲素含量平均值为0.78%。98%高乌甲素标准品(成都普菲德生物技术有限公司)。

1.1.2 实验动物 比格犬3只，由上海睿智化学研究有限公司大动物研究中心提供，编号#1 、#2、#3 (合格证号SCXK(京)2011-0003 11400600000852)，普通级雄性，体重8.1～8.4 kg。

饲养条件:动物房控制室温范围是20.0～26.0℃，相对湿度控制在30%～70%范围内，光照12 h明暗交替，动物清洗期两周。犬饲料购买自北京科澳协力饲料有限公司，检验合格。试验期间每天给予动物饲料2次(上午和下午各1次，每次约100 g·只-1)，动物自由摄水。

1.1.3 试剂 无水乙醇(分析醇),色谱甲醇，乙胺，EDTA-K2，纯净水，等。

1.1.4 主要仪器与设备 箱式微波干燥设备(天水华圆制药设备科技有限公司)；循环水式真空泵(北京中兴伟业仪器有限公司)； 万能高速粉碎机(上海菲力博食品机械有限公司功率: 2 300 W 转速：25 000 r；(日本岛津公司)SPD-20A高效液相色谱仪；Eppendorf 5415R型台式低温离心机(艾本德中国有限公司)；XW-80A漩涡混合仪(海门市其林贝尔仪器制造有限公司)；20～200 μL移液枪(Thermo)；YP100K-5型电子天平(上海良平仪器仪表有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 回流提取高乌甲素 粉碎高乌头根，用60目筛网筛滤2～3次，将细粉混匀取150 g左右备用。连接好回流装置，用75%的乙醇，以1∶10的物料比回流提取2两次，每次回流2 h。

回流结束后取出蒸馏烧瓶冷却至室温，而后真空抽滤，浓缩，真空干燥8 min，得到粗提物，将其研磨成细粉装入自封袋中，待测。

1.2.2 提取物中高乌甲素含量的测定 精确称量样品10.0 mg倒入100 mL容量瓶中，加20 mL甲醇(色谱醇)，超声溶解，冷却至室温，用甲醇(色谱醇)定容，摇匀备用。高效液相色谱检测条件为，色谱柱:Phenomenex C18柱( 150 mm ×4.6 mm，5 μm)；流动相：色谱甲醇(0.1 mol·L-1NaH2PO4)=72∶28(V/V)；检测波长:254 nm；柱温：30℃；流速：1.0 mL·min-1；进样量20 μL；检测时长：30 min。

样品计算方法：样品含量=(样品峰面积×对照浓度)/(对照峰面积×样品浓度)×100%×对照含量。

1.2.3 动物样品采集及处理 参考高乌甲素在人体内的用量，以不同物种、大小动物体表面积系数为依据，近似推算，选用剂量0.5 mg·kg-1。从静脉近心端使血管突起处给药2.03、2.05、2.11 mL[11]。采集给药前(0h)，给药后0.083 h(5 min)、0.25 h、0.5 h、1 h、2 h、4 h、8 h、24 h时间点血液各0.5 mL，采集位置为比格犬未给药的前肢桡静脉。将采集到的血液转移到上述准备的离心管中，震荡倒置至血液与15%EDTA-K2抗凝剂混合均匀。低温离心机4℃、3 000 g离心5 min，吸取上清液200 uL，转移至血浆收集离心管中，干冰-79℃冷冻保存，等待分析。

1.2.4 样品检测及数据分析 血药样品由上海睿智化学研究有限公司进行检测，使用WinNonlin 6.2药学分析软件进行分析，对得到的血药浓度-时间数据，分别使用房室模型及非房室模型进行分析[12]。

2 结果

2.1 高乌甲素液相色谱结果

高乌头细粉以75%乙醇为提取液，经回流提取浓缩干燥后，得到样品。经液相色谱检测，得到图1和图2。高乌甲素标品的液相色谱最高峰出现在11.932 min，峰面积为1 057 900.250(图1)；高乌甲素实验样品最高峰出现在11.798 min，峰面积为172 396.000(图2)。经计算，样品高乌甲素含量为4.21 mg·g-1。

图1 高乌甲素标准品检测

图2 高乌甲素实验样品检测

2.2 比格犬血药浓度-时间曲线

通过对比格犬0 min，5 min，15 min，30 min，1 h，2 h，4 h，8 h，24 h的血浆样品进行分析，得到结果如下：

表1 比格犬各时间点血药浓度

图3 比格犬血药浓度-时间

2.3 房室模型计算药代动力学参数

药物在体内代谢的动态变化过程一般相当复杂，故为方便研究必须将复杂的机体系统进行简化，就是通过建立简化的模型，再用相应相关数学公式进行具体的描述。在这种模型中机体被视为一个系统，并按照各组织器官等不同的动力学特点划分为若干个隔室，因而称其为隔室模型。每种隔室将机体内代谢速率相同或近似的器官、组织归为一类，进行药代动力学计算。一般常用的有一室模型和二室模型。

对三只比格犬的血药浓度-时间数据分别以一室模型、二室模型进行拟合，使用AIC方法(AIC，Akaike Information Cterion，是衡量统计模型拟合优良性的一种标准，值越小则拟合程度越高)判断拟合度。一室模型AIC值分别为62.45069、67.85479、61.75113，二室模型AIC值分别为53.46675、22.10481、42.39236，二室模型AIC值显著低于一室模型，因而选用二室模型进行分析。

表2 二室模型下比格犬药代动力学参数

AUC(area under the time concentration curve，AUC，曲线下分布面积)，K10-HF(K10，从中间室消除的表观一级速率常数，K10-HF，中间室消除半衰期)，Alpha(fast disposition rate constant，α，二室模型中描述药物在体内分布的表观一级混合速率常数)，Beta(slow disposition rate constant，β，二室模型中描述药物消除的表观一级混合速率常数)，Alpha_HL(分布相的半衰期)，Beta_HL(消除相的半衰期)，Cmax(按模型推算出的给药后的最大血药浓度)，CL(清除率，单位时间内清除药物的血浆容积)，AUMC(一阶矩，时间和血药浓度的乘积与时间曲线的下面积)，MRT(Mean Residence Time， MRT，平均滞留时间)，Vss(表观稳态分布容积)，CLD(血浆药物透析清除率)。经检测，公式参数分别为：α=4.935±0.896，β=0.213±0.022，A=113.623±74.279，B=83.267±71.9593。

经计算，平均药代动力学公式为

C=98.925205e^(-4.038817*t)+79.244653e^(-0.234683*t)

2.4 非房室模型计算药代动力学参数

非房室模型在计算药代动力学参数时不依赖于隔室模型，而是以药物浓度-时间曲线下面积作为主要计算依据，不受数学模型的限制，故又称为非隔室分析法(nonconpartment analysis)。该方法计算简便，且适用于缓控释制剂的药代动力学研究。计算得到参数如下：

表3 非房室模型下比格犬药代动力学参数

HL_Lambda_z( half-life，HL，血浆半衰期)：药物在血浆中最高浓度降低一半所需的时间。不同药物的HF相差很大，一般常用的药物按照HF的长短可以分为5类，超快速消除类(HF≤1 h，如青霉素，甲氧西林、萘夫西林等)、快速消除类(HF=1～4 h，如氨苄西林，头孢唑林，克林霉素等)、中速消除类(HF=4～8 h，如林可霉素，土霉素、丙磺舒等)、慢速消除类(HF=8～24 h，如多西环素、美他环素、磺胺嘧啶等)以及超慢速消除类(HF>24 h)。

AUC(area under the time concentration curve，AUC，曲线下分布面积)，AUClast指的从给药时间开始到最后一个点的这段时间的AUC，均值为354 ± 37.6 h*ng·mL-1，AUCINF_obs指的从给药开始到理论外推无穷远的时间的AUC)：代表着被吸收到体内的总药量，均值为430 ± 42.7 h*ng·mL-1。Vss(total volume of distribution，分布容积)：当血浆和组织内药物分布达到平衡后，体内药物按此时的血浆药物浓度在体内分布所需要的体液容积，实验测得Vss均值为5.13±0.560 L·kg-1。

3 讨论

高乌甲素因其有强效镇痛，降温抗炎，增强人体免疫力，不会成瘾，没有致突变和致癌风险等特点，在医药学方面有着非常重要的作用。而关于高乌甲素的镇痛机制研究较多，但说法不一。有研究认为高乌甲素参与阻断电压门控的钠离子通道，通过减少钠离子内流并阻断延迟性钾离子内流，来抑制动作电位的产生而起到镇痛作用[13～14]。还有一些报道认为高乌甲素的镇痛作用与甲肾上腺素和五羟色胺下行抑制系统有关[15～17]。关于高乌甲素在动物体内的药代动力学研究，目前的研究多集中于大鼠和小鼠[18]，而在大型动物体内的研究还较少。

在笔者实验中，按照非房室模型数据，比格犬静脉注射高乌甲素提取液0.5 mg·kg-1，分布容积Vss为5.13 ± 0.560 L·kg-1，理论上药物全部进入血液中，Vss约为0.1L·kg-1，大于此值，即代表相对血药浓度越低，药物可能在某些器官组织中有富集，得值远大于0.1 L·kg-1，即代表此药物在器官内有明显的富集现象，而具体在哪些器官中富集，仍需要进一步实验探究。AUClast和AUCINF分别为354 ± 37.6和 430 ± 42.7 h·ng-1·mL-1，以此为参照，可以计算同等剂量其他给药方式的生物利用度F。MRTlast和MRTINF_obs分别为2.586±0.05529和4.38175±0.127。半衰期HF为 3.31 ± 0.155 h，代谢速度属于快速消除，药效时间相对较短，作为镇痛药品，可能难以满足宠物犬的临床使用。但因为是血管内途径给药，药物直接进入血液，没有吸收过程，所以应考虑其他吸收较慢的给药方式，如皮下注射、肌肉注射或静脉滴注等，或考虑其他剂型如载体制剂、缓控释制剂等，增加半衰期HF，提高有效血药浓度时间。

比格犬静脉注射高乌甲素0.5mg·kg-1，按照二房室模型数据，公式参数分别为：α=4.935±0.896，β=0.213±0.022，A=113.623±74.279，B=83.267±71.9593，以此模型可以为其他相关研究提供参考。