猪瘟检测技术研究进展

2020-07-04但蕊桐李虹霓许静黄兰香

科学与财富 2020年15期

但蕊桐李虹霓许静黄兰香

摘要：猪瘟是世界动物卫生组织（OIE）列出的16种A类传染病之一，我国也将其列为一类动物疫病。本病致死性及传染性极强，在给生猪产业造成巨大冲击、影响群众生活的同时，也给我国社会经济和国际贸易造成巨大损失，因此无论政府还是生猪养殖企业都一直把对猪瘟及时准确的检测作为保证生猪产业健康发展的手段之一。本文作者通过查阅大量文献资料，总结归纳了猪瘟检测技术方面的发展现状，以期为猪瘟高效准确的检测提供技术参考，为猪瘟的有效防控提供理论依据。

关键词：猪瘟;检测;技术

猪瘟（CSF）是由黄病毒科瘟病毒属的有囊膜的单股正链RNA猪瘟病毒（CSFV）[1]引起的高度接触性、出血性猪传染病。至今已经流行了70多年，是我国四大动物疫病之一。其主要流行特点是流行范围广，流行没有明显的季节性，发病猪年龄普遍较小，仔猪是主要的发病群体[2]。近年来猪瘟发病时的病症更加温和但发病持续时间较以往变得更长，表现出持续性感染和混合感染[3]。目前已知的猪瘟病症在临床上可分为最急性型，急性型，慢性型，温和型[4]。我国自新中国建立以来就一直重视猪瘟的防控工作，在这方面积累了相当的经验，但通过疫苗接种控制猪瘟的策略近年来一直没有达到理想的效果，在这种情况下，掌握敏感、高效、准确的猪瘟检测技术尤为重要。本文就现有的猪瘟检测技术种类及其优缺点进行综述，为猪瘟的诊断技术提供参考。

1.分子生物学检测

1.1 RT-LAMP

逆转录环介导等温核酸扩增（RT-LAMP）是Notomi[5]等人在环介导等温核扩增技术基础上衍生出的一种能够检测RNA病原的新型检测技术。优点是简单便捷，不需要精密的仪器和特殊的试剂。原理是在原始环介导等温核扩增反应中加入逆转录酶，通过对靶序列上的特异性引物和特殊DNA聚合酶的识别[6]从而对RNA进行扩增[7]。自陈蕾[8]于2009年研制出猪瘟RT-LAMP试剂盒，近年来RT-LAMP技术在猪瘟检测领域被广泛运用。曾小娜[9]等人的研究结果显示此方法灵敏度高达10-5，最低能检测到1pg的RNA，反應快速可在1h内完成。且通过实验可知RT-LAMP方法的灵敏度是RT-PCR的100倍，进一步证明了RT-LAMP方法的优越性。

1.2 RT-PCR

逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）是对病毒特异性基因进行扩增从而达到检测目的。其优点是特异性好，敏感性高。波丹、黄宪高等人[10]于2000年对此方法进行了初探。RT-PCR可以扩增病毒的特异性核酸片段，从而解决猪瘟病毒和同属病毒在血清学检测中难以辨别的问题。初步肯定了RT-PCR特异性高的优点。后来的研究发现RT-PCR技术最低能检测到100 pg微量的猪瘟病毒核酸[11]，进一步肯定了RT-PCR敏感性好的优点。陈创夫[12]等人采用了多种检测方法对9份猪瘟病料进行了检测。结果表明，用RT-PCR法检测出的阳性率最高。但由于此方法对仪器和操作人员要求较高，需要高精确度 PCR 仪和装备良好的实验室条件，故对于基层检测难以开展。

1.3荧光定量RT-PCR

荧光定量RT-PCR法的原理与普通的RT-PCR检测大同小异，只是在其检测过程中引入了荧光染料作为标记，再通过荧光PCR仪进行扩增[13]。虽然原理类似，但因为有了荧光染料的加入，使对目的扩增片段的识别更敏感、特异性更强，过程更迅速，结果更明显。国外很早就将该法运用于猪瘟的定量检测中[1]。余以刚黄韵[14]等人用荧光定量PCR的方法分别鉴别野毒株和疫苗株，其灵敏度达到1TCID50/mL和0.1TCID50/mL，组内和组间变异系数均在0.7-2.2%之间，以上结果均显示优于普通RT-PCR。王淑娟[15]等人用已知的35份疑似猪瘟病毒感染样品，通过普通RT-PCR法检出的阳性数量为21份，采用荧光定量RT-PCR法则检出23份阳性，可知此方法检出率更高。

1.4重组酶聚合酶扩增

重组酶聚合酶扩增检测是由英国剑桥的NiallArmes等人[16]于2006年开发的一种可快速检测的新型等温核酸扩增方法，是近年来常用的猪瘟检测技术。其基本原理是依靠一种能产生多种蛋白质活性的DNA代谢反应。所用引物寡核苷酸在重组酶的作用下插入和结合于DNA双链互补序列中，再以类似于PCR的方式对DNA的特定区域进行指数扩增[17]。该法对于反应温度、设备的要求较低，从而能更大限度的减少成本。且在低成本的前提下，反应时长也更短，5-30min内即可完成，灵敏度和特异性也相对更优[18]。根据王金凤等人[19]的研究结果显示，所建立的RT-RPA方法仅对猪瘟病毒有特异性扩增条带，而对其他猪常见病原没有特异性扩增结果。在57份临床样品的检测中，RT-RPA方法的阳性检出率为56.14%（32/57），而实时RT-PCR方法的检出率为64.91%（37/57）。但由于至今仍然没有专门用于RPA引物设计的软件，只能靠大量的合成与筛选，在这方面的成本和时间消耗很大，有时甚至无法设计出理想的引物与探针，故该法的普及也有待进一步的研究发展。

2.免疫学检测

2.1胶体金免疫层析抗体检测

胶体金免疫层析技术是一种问世不久的能在体外进行的检测技术，是在胶体金标记技术和免疫层析技术共同基础上所创立[20]。一般可以分为两大类[21]，其中GICA由于胶体金制备简便，标记简单纯化也不复杂[22]。故自发现以来就得到了广泛的应用。其主要原理是抗原抗体在固相膜上反应，然后用胶体金标记过的抗体进行显色反应，来判断是不是阳性。2004年姜建宏，周艳君等人[23]发现与ELISA相比，胶体金免疫层析技术对人体危害小。王向鹏等人[20]对六种猪瘟诊断方法进行研究比较，选择50 份样品进行胶体金检测，被检测出的阳性占其中的16%，但病毒分离方法检测出的阳性数量更多。说明其敏感性不足，故主要用于对畜群进行检测，不适合个体检测。

2.2双抗体夹心ELISA

双抗体夹心ELISA法是目前最常用的检测猪瘟抗原的检测方法之一，其原理是特异性抗体与待检血清中的抗原，在固相载体上结合形成免疫复合物。洗去未结合的样品之后加入酶标记抗体，与免疫复合物中的抗原结合形成酶标抗体-抗原-固相抗体复合物，再在酶反应底物的催化下反应，最后通过显色反应，从而判断抗原含量。汤赛冬，周雪芳等人[24]建立的夹心ELISA检测方法，经过特异性和重复性的检验得出阳性结果符合率高达97.7%的结果。从而说明该方法有较好的特异性。双抗夹心ELISA的猪瘟抗原检测方法可直接检测猪瘟病毒，对早中期的检测都具有优势[22]。该检测方法不仅可以检测新鲜组织和组织细胞培养物，而且对于检测大批量的活动物血液样品也极为适用，所以可运用于出入境检验检疫[25]。但此方法操作时间较长（两天），具有一定局限性[26]。

2.3 IPMA检测方法

免疫过氧化物酶单层细胞试验（IPMA）其原理是在单层细胞中加入一抗和带有HRP（辣根过氧化物酶）的二抗，最后再加入促进显色反应的酶，通过光学显微镜观察是否有特异性显色反应来判断阳性与否。根据张振仓魏丽娜等人[27]建立的猪瘟病毒IPMA检测方法的结果显示，IPMA与RT-PCR和ELISA阳性检测结果符合率均可达92%以上。且由谭斌[28]等人针对高致病性猪蓝耳病毒发明的IPMA抗体检测试剂盒也与其他病毒的参考血清无交叉反应，说明IPMA法具有良好的特异性和可靠性。但由于此方法得出的实验结果容易受到个人主观因素的影响，故并未广泛应用。

3.结语

猪瘟作为世界各国重点关注和控制的猪的传染病之一，对我国乃至世界范围内养猪业影响极大，故自此病被首次发现以来，其检测方法的研究一直为国内外学术界所关注，并成为一大研究热点。目前关于猪瘟的检测方法的研究呈现出良好的成果，已有的检测技术对猪瘟的防控做出了巨大的贡献。但不可否认的是这些检测技术依旧存在一些局限性，目前广泛用于猪瘟检测的方法，普遍不能完全满足快捷方便，特异型敏感性良好，耗材低廉的需求。近年来得益于国内外研究人员的努力，不少新型检测方式逐步被建立创造出来，对猪瘟的检测研究呈现出良好态势。我们相信在未来会不断涌现出更多满足以上人们需求并能广泛推广于基层中的检测方法。

参考文献：

[1]G， R.， et al.， Diagnostic evaluation of a real-time reverse transcriptase PCR assay for detection of classical swine fever virus. Journal of clinical microbiology， 2005（1）.

[2]涂長春，中国猪瘟流行病学现状与防制研究. 2004，中国农业大学.

[3]徐佳，猪瘟的流行病学、临床症状、剖检变化及防控措施. 现代畜牧科技， 2019（04）： p. 110-111.

[4]苏双，张丽媛， and 刘欣，猪瘟流行的新特点、临床症状与剖检变化. 兽医导刊， 2009（10）： p. 30-31.

[5]T， N.， et al.， Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic acids research， 2000（12）.

[6]肖斌，朱永红， and 邹全明，简便敏感的环介导等温扩增基因诊断新技术. 中华检验医学杂志， 2005（07）： p. 761-763.

[7]Whiting， S.H. and J.J. Champoux， Properties of strand displacement synthesis by moloney murine leukemia virus reverse transcriptase： mechanistic implications 1 1 Edited by M. Gottesman. Journal of Molecular Biology， 1998（3）.

[8]陈蕾，猪瘟病毒RT-LAMP快速诊断试剂盒的研制与应用. 2009，中国兽医药品监察所.

[9]刘中勇， et al.，猪瘟病毒RT-LAMP快速检测方法的建立. 中国畜牧兽医， 2010. 37（06）： p. 71-74.

[10]罗廷荣， et al.， RT-PCR检测猪瘟病毒初探. 广西农业生物科学， 2001（01）： p. 17-20.

[11]谢志勤， et al.， RT-PCR检测猪瘟病毒方法的建立与应用. 畜牧与兽医， 2002（11）： p. 11-14.

[12]乔军， et al.，用RT-PCR法对猪瘟病毒检测的研究. 塔里木农垦大学学报， 2001（04）： p. 25-27.

[13]祖立闯， et al.，猪瘟病毒实验室检测方法研究进展. 养猪， 2016（06）： p. 117-118.

[14]余以刚， et al.，猪瘟病毒野生株和疫苗株荧光RT-PCR鉴别方法的建立. 现代食品科技， 2013. 29（08）： p. 1978-1983.

[15]王淑娟， et al. 猪瘟病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用. in 中国猪业科技大会暨中国畜牧兽医学会2015年学术年会. 2015. 中国福建厦门.

[16]Olaf， P.， et al.， DNA detection using recombination proteins. PLoS biology， 2006. 4（7）.

[17]Huimin， D. and G. Zhiqiang， Bioanalytical applications of isothermal nucleic acid amplification techniques. Analytica chimica acta， 2015. 853.

[18]施奕， et al.，重组酶聚合酶扩增技术研究进展. 病毒学报： p. 1-11.

[19]王金凤， et al.，猪瘟病毒重组酶聚合酶扩增检测方法的建立及应用. 中国兽医科学， 2019. 49（06）： p. 687-693.