王 姝 吕晓楠 徐立蒲 张 文 王静波 王小亮 曹 欢

（北京市水产技术推广站 北京 100176）

1 前言

鲤疱疹病毒Ⅱ型（CyHV-2）是能感染金鱼和鲫鱼并引起造血器官坏死的高致病性病原[1，2]。感染病毒的鱼行动迟缓、腹部膨大、体表出血[3]。一旦发病，死亡率在50%以上，甚至可达90%。CyHV-2首次在日本养殖的金鱼体内分离出，之后迅速蔓延至美国、中国、澳大利亚、英国等国家[4-6]。该病毒传入我国后，在鲫鱼主养区暴发，造成养殖金鱼和鲫鱼的大批死亡，仅2012年江苏养殖鲫鱼发病面积就达约3万ha[7]。

目前，尚无敏感细胞系可用于分离CyHV-2，检测主要依赖于荧光聚合酶链式反应（PCR）、套式PCR等分子生物学方法[8，9]。这些方法对检测人员有较高的技术要求，且难以实现非实验室现场的快速检测及基层普及。为了更好地通过检测发现潜在病毒，及时采取防控措施，控制疾病扩散，应建立快速、简便的适用于现场检测CyHV-2的方法，作为现有方法的有力补充。

重组酶介导扩增法（Recombinase-Aid Amplification，RAA）[10]、重组酶聚合酶扩增法（Recombinase Polymerase Amplification，RPA）[11]等恒温核酸扩增技术，在37℃～39℃下依赖于特异性寡核苷酸引物或探针的侧向流试纸条（Lateral Flow Dipstick，LFD）检测目的基因片段，具有灵敏度高、特异性强、检测时间短、肉眼读取结果、操作简便等优点。目前，RAA、RPA快速检测方法已经应用于鸡传染性喉气管炎病毒等陆生动物病毒[12，13]以及传染性造血器官坏死病毒（IHNV）等水生动物病的原检测领域[14]。

本研究以RAA技术为基础，联合胶体金LFD技术，建立了一种可以在现场快速、准确检测CyHV-2的方法，为有效防控CyHV-2提供技术支持。

2 材料与方法

2.1 主要实验材料

材料:2012—2017年，在22个北京观赏鱼场采集养殖金鱼样品，每个样品含10～15尾鱼。取每尾鱼的肾、脾组织，研磨成组织液，备用。鲤春病毒（SVCV）、鲤浮肿病毒（CEV）、传染性造血器官坏死病毒（IHNV）、草鱼出血病毒（GCRV-9014）、锦鲤疱疹病毒（KHV）、斑点叉尾鮰疱疹病毒（CCV）、流行性造血器官坏死病毒（EHNV）均由本实验分离保存。

试剂:DNA Blood Mini Kit试剂盒（QIAGEN公司）；RAA核酸扩增试剂（杭州众测生物技术有限公司）；2×Power Taq PCR MasterMix（北京百泰克生物技术有限公司）；引物（上海生工生物工程技术服务有限公司）。

2.2 重组质粒的构建与定量

由北京华大基因合成CyHV-2的helicase基因序列（1446bp），将其克隆至pUC57载体上，构建成标准质粒pUC57-CyHV-2，标准质粒浓度约为10.6ng/μL。该重组质粒经测序鉴定正确后，测定其浓度并根据公式{质粒浓度（ng/μL）×10-9/[660×（质粒长度+载体长度）]}×6.023×1023=质粒拷贝数（拷贝/μL）换算为其拷贝数。

2.3 引物的设计与筛选

对GenBank中登录的CyHV-2的helicase基因序列（参照GenBank Accession AFJ 20501）进行比对，依据RAA引物设计原则，采用DNAman 6.0软件进行序列比对分析，选取同源性高的片段，用primer 5.0进行引物设计（表1）。以pUC57-CyHV-2标准质粒（8×105拷贝/μL）作为模板，对 RAA 引物进行筛选。扩增反应参照试剂盒说明书进行。反应条件采用37℃孵育10 min，反应结束后经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测RAA产物。选择扩增条带单一的1对引物，对上、下游引物5’端分别用异硫氰酸荧光色（FITC）和生物素（Biotin）进行标记，合成与标记由上海生工生物工程技术服务有限公司完成，标记后的引物用于后续的方法建立。

表1 用于GFHNV检测的引物信息

2.4 RAA-LFD方法的优化及建立

所有优化试验均以标准质粒pUC57-CyHV-2（8×105拷贝/μL）为模板。采用方阵法对标记的引物（366-CyHV-2-hel-F/R）的浓度（1、5、10、50、100 μmol/L）、反应温度（25℃、34℃、37℃、40℃、45℃）、反应时间（5、10、15、20、25 min）进行优化，反应体系参照 RAA 试纸条型核酸扩增试剂盒。

所有优化试验的扩增产物均通过LFD检测。为防止反应产物产生的气溶胶影响检测结果，本研究将50 μL RAA反应产物直接放于装置内，与装置自带液泡缓冲液充分混合后竖立在水平操作台上，在3~5 min后观察并拍照记录结果，选择阳性样品出现最强检测线和质控线、阴性样品不出现检测线仅出现质控线时的条件作为RAA-LFD的优化条件。

2.5 灵敏度实验

比较已建立的RAA-LFD检测方法与CyHV-2的helicase基因标准PCR检测方法[15]的灵敏度。将标准质粒pUC57-CyHV-2进行10倍系列稀释，浓度从 8.13×100～8.13×108拷贝/μL 的梯度稀释，分别以其为模板进行RAA-LFD检测和常规PCR检测。

2.6 特异性实验

利用Qiagen RNA提取试剂盒抽提IHNV、SVCV、GV-9014的核糖核酸（RNA），并将其逆转录为相应的互补脱氧核糖核苷酸（cDNA）。采用Qiagen DNA提取试剂盒抽提CEV、KHV、EHNV、CCV基因组DNA。利用已建立的RAA-LFD检测方法检测上述cDNA和DNA。

3 结果

3.1 引物筛选

根据RAA的引物设计原则共设计了4对CyHV-2特异性引物，利用杭州众测的RAA核酸扩增试剂盒对引物进行筛选。结果显示，4对引物均能够扩增出目的条带，但引物CyHV-2-3-R、CyHV-2-3-F扩增的产物较单一且明亮（图1），因此选择其作为建立RAA-LDFD方法用的引物，并在上、下游引物的5’端分别标记FITC和Biotin，以便用胶体金LFD检测扩增产物。

图1CyHV-2的RAA引物筛选

3.2 特异性试验

分别以IHNV、SVCV、GV-9014的cDNA和CEV、KHV、EHNV、CCV的DNA为模板验证已建立的检测CyHV-2的RAA-LFD方法的特异性。结果显示，仅CyHV-2的DNA模板出现正常扩增，在试纸条上同时出现检测线和质控线。阴性对照（DEPC处理水）及IHNV、SVCV、CEV、KHV等样品均未出现扩增，仅出现质控线（图2）。由此可知，该方法能特异性扩增出CyHV-2中的靶序列，而不与其他病毒核酸发生交叉反应。

图2 检测CyHV-2的RAA-LFD方法的特异性

3.3 灵敏度试验

采用倍比稀释的标准质粒作为模板，比较RAALFD方法与常规PCR的敏感性。结果显示，本实验建立的RAA-LFD方法最低检出限为8×100拷贝/μL（图 3a），普通 PCR 的检出限仅为 8×101拷贝/μL（图3b），表明本研究建立的RAA-LFD方法敏感性高于普通PCR。

图3 检测CyHV-2的RAA-LFD方法的敏感性

3.4 临床样品检测

利用所建立的RAA-LFD方法与PCR方法分别检测疑似病例45份。检测结果显示RAA-LFD检测出阳性样品22份，阴性样品23份；普通PCR检测出阳性样品20份，阴性样品25份。2种方法的阳性符合率为95%，表明本研究建立的RAA-LFD方法可用于CyHV-2的现场检测。

4 讨论

疱疹病毒的特点之一是潜伏感染。在CyHV-2感染实验的第151天后，日本学者用PCR方法在5尾表面健康实验鱼体内检测到4尾鱼是CyHV-2阳性[16]。也有学者对18个渔场中的健康金鱼进行定量PCR检测，14个渔场的样品是CyHV-2阳性[17]。潜伏感染给CyHV-2的确诊带来难度。尽早发现病毒感染，尽快采取积极的防控措施，是降低因CyHV-2感染发病而造成鱼类死亡的关键环节，也是避免引入潜伏感染苗种的重要保障。

现有的鱼类细胞对CyHV-2敏感性低，细胞培养方法在建立更加敏感而稳定的细胞系后才能被广泛使用[18]。目前，检测 CyHV-2最普遍有效的方法是PCR扩增技术，包括普通PCR技术、实时荧光定量PCR技术、LAMP技术等。Waltzek等[19]基于CyHV-2的解旋酶基因建立了常规PCR，该方法具有较高的特异性和敏感性，针对构建的质粒和患病金鱼肾脾组织DNA抽提液的分析灵敏度分别为78拷贝/μL和84 拷贝/μL，与普通 PCR 的检出限（8×101拷贝/μL）一致。

RAA是一种借助于重组酶、聚合酶和单链结合蛋白的新型等温扩增技术。与其他DNA扩增技术相比，RAA不需要特殊设备即可在更短时间内和较低温度下将目的DNA扩增至可检测水平。LFD是不需昂贵复杂仪器，可操作性高的可视化检测工具。本研究联合2种技术，按照RAA引物原则设计引物及探针，通过引物筛选、灵敏度和特异性实验、临床样品检测，建立了一种针对CyHV-2的RAA-LFD检测方法。该检测方法在37℃恒温下反应10 min，即可实现对CyHV-2目的基因片段的有效扩增，操作简便，并与其他常见水生动物疫病病原核酸无交叉反应；RAA扩增产物直接用LFD肉眼观察，最低检测限为8拷贝/μL，敏感性比普通PCR高10倍。对45份疑似病例进行检测，2种方法符合率可达到95%，本研究建立的RAA-LFD方法可用于CyHV-2的现场检测。