李玮 徐樱 项金华

癌症相关数据结果显示：肺癌已成为患病率、致死率最高的一种肿瘤，同时其也是全球死亡率最高的肿瘤[1-2]，其中非小细胞肺癌占肺癌的80%～85%[3]，其首选治疗手段是手术切除，同时术后放化疗可显著降低非小细胞肺癌的复发和转移，但临床数据显示治疗后其5年生存率仍低于15%，其中一部分原因是多药耐药(MDR)对肺癌化疗效果产生影响[4-5]。Lnc RNA是长度大于200个核苷酸的非编码RNA，其在遗传调控、细胞周期调控及细胞分化调控等多个生命活动中均有重要作用[5-7]，已经成为遗传学的研究热点之一。本文研究发现，LncRNAFENDRR与非小细胞肺癌的发生、发展密切相关，FENDRR过表达可抑制肺癌细胞增殖，降低细胞侵袭及迁移能力，促进癌细胞凋亡，分析如下。

资料与方法

一、标本与试剂

选择2018年至2019年长沙市第三医院收治的60例非小细胞肺癌患者作为标本来源(其中男30例，女30例，年龄35～68岁，均经病理学诊断确诊为非小细胞肺癌)，取其非小细胞肺癌组织及距肿瘤3cm以上癌旁组织作为标本；A549细胞系购自南京科佰生物科技有限公司，载体pcDNA-FENDRR购自江苏泓讯生物科技股份有限公司，Real-time PCR基因检测试剂盒购自赛默飞世尔公司，PCR引物合成由金唯智生物科技公司完成，脂质体转染试剂采自赛默飞世尔公司，MTT试剂盒购自默沙克生物科技有限公司，细胞凋亡试剂盒购自全式金生物科技有限公司，Matrigel基质胶购自BD Biosciences公司，结晶紫染液购自碧云天公司。

二、试验方法

1 Real-tine PCR 取非小细胞肺癌肺癌组织及癌旁组织，用液氮冷冻后粉碎，提取两种组织的总RNA，逆转录为cDNA，扩增FENDRR基因后，设计其引物，取GAPDH基因作为内部参数，参照实验所得的Ct值对FENDRR实施相对定量分析，定量分析方法为Ct值法。

2 细胞转染 将A549细胞系细胞行常规培养，待其处于对数期且达到80%融合后取出待用，按照说明书，将重组载体pcDNA-FENDRR转染至A549细胞，转染时间为2h，之后更换为正常培养基，再培养48h后取出并检测。

3 细胞增殖活力检测 将A549细胞系分为空白对照组及FENDRR转染组，空白对照组未实施转染A549细胞，未进行任何干预，FENDRR转染组细胞接受pcDNA-FENDRR转染，使用MTT法分析两组细胞增殖活力。

4 细胞凋亡率检测 收集两组A549细胞，使用PBS液制作成细胞悬浮液后在4℃、1000r/min下离心2min，再使用PBS洗脱并离心，重复2次后使用PBS制作为细胞悬浮液，之后常温培养15min，再用细胞凋亡试剂盒行细胞凋亡率检测。

5 细胞迁移能力检测 收集两组A549细胞，消化后调整细胞浓度，将细胞悬液加入至Transwell小室的上室，再将含胎牛血清(FBS)的DMEM培养基加入至下室，之后置于含5 % CO2的37℃培养箱孵育24 h，取出小室取，在400倍高倍镜下计数，每张片子随机记录5个视野的迁移细胞数，细胞迁移数为每张片子五个视野总数视(设置3个重复)。

6 细胞侵袭能力检测 将Matrigel胶在4℃下解冻，用不含胎牛血清(FBS)的DMEM培养基培养：将Matrigel胶按8:1比例稀释，在冰上混匀，之后将混合液加入Transwell小室上室，置于含5 % CO2的37℃培养箱孵育1～2 h，再接种细胞，其余过程同迁移检测。

三、统计学方法

结 果

一、FNDRR mRNA在非小细胞肺癌及癌旁组织中表达量对比

Real-time检测结果中，FENDRR在非小细胞肺癌与癌旁组织中相对表达的△△Ct为1.366，其在非小细胞肺癌组织中的相对表达量为癌旁组织的35.62%，在非小细胞肺癌组织中表达量明显低于正常癌旁组织(P<0.05)。

二、FENDRR表达与非小细胞肺癌分级及T分期相关性分析

随着非小细胞肺癌分化程度的降低及T分期的升高，FENDRRmRNA表达逐渐降低(P<0.05)，但其在非小细胞肺癌N、M分期中变化无显著性差异(P<0.05)(见表1)。

三、FENDRR基因表达对A549细胞增殖活力及凋亡率影响

Real-time PCR检测结果表明，与空白对照组A549细胞相比，FENDRR转染组A549细胞中FENDRR mRNA表达量显著上升，A549细胞的增殖活力显著降低，凋亡率显著上升(P均<0.05)(见图1)。

四、FENDRR基因表达对A549细胞迁移及侵袭能力的影响

表1 FENDRR表达与非小细胞肺癌分级及T分期相关性分析

图1 FENDRR基因表达对A549细胞增殖活力及凋亡率影响

注：A为FENDRR-mRNA表达量；B为A549细胞增殖活力；C为A549细胞凋亡率(%)；****P<0.0001，与空白对照组比较

细胞迁移能力检测结果表明，与空白对照组相比，FENDRR转染组A549细胞迁移及侵袭能力明显降低(P<0.05)(见图2)。

图2 FENDRR基因表达对A549细胞迁移及侵袭能力的影响

注：**P<0.01，***P<0.001，与空白对照组比较

讨 论

有研究显示，近年来我国居民肺癌的发病率和致死率逐年增加，不仅影响居民的生命健康，也对我国经济和社会发展产生不利影响[8-9]。非小细胞肺癌在肺癌中占比最高，具有肿瘤组织分裂速度慢，扩散较晚的特点，但其临床症状不明显，使得临床上在前中期不能及时发现，使得其致死率较高[10-12]。

随着我国人类全基因组研究的进行，具有编码蛋白质的基因逐渐被发掘出来，其在各类疾病中有重要作用，目前其已用于胆道闭锁自身免疫研究中[13-15]。Lnc RNA是一类非编码RNA，近年来研究指出，多种肿瘤中Lnc RNA存在异常表达[7]。有研究发现[16]，Lnc RNA与肝癌及其相关疾病密切相关，可通过表观遗传调控、促进血管生成、增加脂质代谢异常等方式对肝癌的发生、发展及预后产生影响，因此可将Lnc RNA作为肝癌诊断标志物及新型治疗靶点。

相关研究指出，FENDRR可通过影响复合物2来调控原癌基因及肿瘤抑制基因，从而影响肿瘤进程[17-18]。本文结果表明， 非小细胞肺癌癌组织中FENDRR的表达明显低于癌旁组织，进一步分析显示，FENDRR表达与非小细胞肺癌患者肺癌分化程度及T分期密切相关，癌细胞分化程度越低、T分期越高，FENDRR表达越低(P<0.05)，而在T分期各阶段对比无统计学差异(P>0.05)，其表明FENDRR基因与非小细胞肺癌的发生、发展密切相关，但其与癌症N及M分期无相关性[19]。同时与空白对照组细胞相比，FENDRR转染的A549细胞系其增殖活力、迁移能力和侵袭能力均明显下降，而凋亡率明显上升(P<0.05)，表明FENDRR基因可抑制非小细胞肺癌细胞增殖，降低癌细胞侵袭及迁移能力，从而发挥抑癌基因的作用，可能与其可抑制MDR1的表达相关，以上结果与学者陈滢[20]等的研究结果相一致。

综上所述，LncRNAFENDRR与非小细胞肺癌的发生和发展密切相关，FENDRR过表达可抑制癌细胞增殖、降低细胞侵袭和迁移能力，促进癌细胞凋亡，其可作为未来非小细胞肺癌的治疗新型靶点。