邹远妩 王婷 李王平

中国是耐药结核病高负担国家，低治愈率、高死亡率是耐药结核病的治疗难点。WHO将氟喹诺酮类药物列为A类核心药物，用于治疗耐多药结核病[1]，在我国因该类药物较易获得，故被广泛应用。导致近年来该药耐药率逐渐上升。可靠的药物敏感性试验(drug sensitivity test,DST)结果是耐药结核病实施化学治疗的基础[2]。耐药结核病的诊断主要依靠细菌耐药表型检测和基因型检测，表型检测法可靠性和可重复性较好[3]，但其或检测周期长，或费用高。随着分子生物技术的发展，以及近年来对结核分枝杆菌 (Mycobacterium tuberculosis,MTB)耐药机制的深入研究，通过检测MTB耐药基因突变快速诊断耐药结核病成为可能。国内大多文献只报道MTB对一线抗结核药物突变的检测，对二线抗结核药物耐药突变研究多因病例少，代表性差[4]。本研究应用溶解曲线法检测MTB临床分离株对二线抗结核药物氟喹诺酮类药物的耐药突变，以评价溶解曲线法在耐药结核病诊治中的应用价值。

资料与方法

一、菌株来源

收集本实验室经临床患者痰液分枝杆菌液体培养阳性并鉴定为MTB临床分离株555株，同时进行荧光 PCR 溶解曲线法和罗氏药物敏感试验检测其对氟喹诺酮类药物耐药情况，以罗氏药敏法为金标准，对检测结果进行统计分析。

二、检测方法

1、分离培养，仪器及配套试剂和MGIT培养管均来自美国BD公司，临床标本按要求进行前处理后接种到MGIT培养管，并将其放入Bactec MGIT 960 分枝杆菌液体培养系统进行孵育。

2、抗酸染色，将上述培养阳性液体按照《结核病实验室检验规程》[5]要求进行涂片抗酸染色镜检(采用珠海贝索生物技术有限公司萋尼氏染色液)。

3、结核分枝杆菌菌种鉴定，采用杭州创新生物检控技术有限公司生产的结核分枝杆菌抗原检测试剂卡对抗酸染色阳性的培养液进行菌种鉴定。

4、罗氏药物敏感试验，将鉴定为结核分枝杆菌阳性的培养液按照《结核病实验室检验规程》[5]要求，接种于含有左氧氟沙星、莫西沙星药物的罗氏药敏培养管进行药物敏感性实验(购自珠海贝索生物技术有限公司)；结果判断：固体培养耐药百分比大于1%判为耐药。

5、溶解曲线法检测氟喹诺酮类药物耐药突变基因，将上述结核分枝杆菌阳性培养液作为样本，按照厦门致善生物科技有限公司生产的结核分枝杆菌氟喹诺酮类耐药突变检测试剂盒操作要求提取TB DNA加入反应管后，利用上海宏石生物科技有限公司生产的荧光定量PC仪进行扩增和溶解曲线分析；结果判断：样品的 Tm 值与阳性对照的Tm值一致即为野生型；样品的 Tm 值低于阳性对照 2℃或以上即为突变型。

三、统计方法

应用SPSS15.0建立数据库，采用卡方检验对两种检测方法结果耐药性进行比较，以P<0.05 为差异有统计学意义。以传统罗氏药敏法为金标准,计算溶解曲线法的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、约登指数、符合率。

结 果

一、两种方法检测结果

两种方法检测555例临床分离株耐药情况。传统药敏法检测41株对LFX耐药，耐药率为7.39%，32株对MFX耐药，耐药率为5.77%；其中41株耐LFX的分离株中有32株同时MFX耐药,9株对MFX敏感。溶解曲线法检测有68株为氟喹诺酮突变株，耐药率为12.25%(68/555)。

二、溶解曲线法与传统方法检测结果比较

表1 溶解曲线法检测左氧氟沙星耐药突变与传统方法比较

表2 溶解曲线法检测莫西沙星耐药突变与传统方法比较

3 溶解曲线法检测结核分枝杆菌氟喹诺酮类药物耐药突变检测效能

以罗氏药敏法为标准，溶解曲线法检测结核分枝杆菌左氧氟沙星、莫西沙星耐药突变的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、约登指数、符合率(见表3)。

表3 溶解曲线技术检测结核分枝杆菌对氟喹诺酮类药物耐药突变检测效能

讨 论

化学疗法是结核病最重要的治疗手段[6]。WHO《耐多药和耐利福平结核病治疗指南》2018年更新版中将莫西沙星、左氧氟沙星、利奈唑胺、贝达喹啉作为A类核心药物[1]，氟喹诺酮类药物中莫西沙星在治疗广泛耐药结核病时不仅作为首选药物，还需要全程使用[3]。

表型药敏检测是传统的诊断标准，因MTB缓慢生长特性造成该类实验耗费时间过长，不利于疾病的早期诊断和治疗，因此会造成耐多药结核(multi-drug resistant tuberculosis，MDR-TB)传播和延迟对患者的治疗[7]。实时荧光PCR 溶解曲线法与传统表型方法相比具有较高的一致性[4,8-9]本研究显示荧光 PCR 溶解曲线法与罗氏药敏法对二线抗结核药物中左氧氟沙星和莫西沙星的检测结果一致性高，与文献所述一致。该实验用时3小时，使耐药结核病快速诊断、治疗成为可能，从而减少传染源也避免了因经验疗法给患者和社会造成的损失。

本研究中罗氏药敏法测试耐药而溶解曲线法未检测到耐药突变一共有11株。可能有两方面原因：1.研究发现MTB对氟喹诺酮类药物的耐药基因及突变位点75%～94%为gyrA基因的67～106位密码子，5%～15%为gyrB基因的突变，本研究只检测了检测突变率极高的gyrA88位、90位、91位、94位突变，所以只能检测到这几个主要耐药基因型，而未能检测到罕见基因型突变；2.有可能患者为异质性耐药，即同时分离出敏感菌株和耐药菌株的现象，传统法可阳性检出仅含1%耐药菌株的标本，而分子方法可能难以检出[10]。在今后工作中应运用多种检测手段相结合，借助基因测序检测方法证实上述可能。

溶解曲线法可用于耐药结核的快速检测，但在实际应用中仍存在一些问题：1)目前本实验只对临床分离株进行检测，不适合临床快速诊断需求。本实验室正在尝试直接用临床标本进行检测，减少临床等待时间，实现快速诊断。2)溶解曲线法检测两种药物的阳性预测值都很低，而阴性预测值很高，说明患者极有可能存在除左氧氟沙星和莫西沙星以外其他氟喹诺酮类药物的耐药突变。莫西沙星、左氧氟沙星在耐多药结核病治疗中有非常重要的作用[11]，故在临床治疗中应结合临床综合考虑制定治疗方案，不能以此作为放弃该类药物的依据。另外，高耐药的数据也提示我国应对氟喹诺酮类药物的使用进行管控。减少由于药物滥用引起的药物敏感性降低。

综上所述：传统药敏试验虽然耗费时间长，但在临床治疗效果不佳时可作为调整方案的重要依据，在现阶段临床治疗中仍有不可替代的作用。