牛欣宁 王步军

中国农业科学院作物科学研究所 / 农业农村部谷物品质监督检验测试中心, 北京 100081

伏马毒素(Fumonisins), 是由串珠镰刀菌(Fusarium moniliforme)、轮状镰刀菌(Fusarium verticillioides)等在适宜的温度和湿度条件下产生的一种次级代谢产物。到目前为止, 已发现A、B、C 和P 四大类共28 种伏马毒素, FB1、FB2、FB3 三种最为常见, 其中FB1 污染最多, 含量最高(约占60%)、毒性最强、对谷物的污染最为严重[1-2]。伏马毒素易溶于甲醇、乙腈、水等极性溶剂, 具有极强的热稳定性, 广泛存在于玉米、小麦、水稻等粮食作物及其加工制品中, 主要污染玉米及其制品, 可通过食物链进入人体及动物体内, 引起各种疾病, 包括神经毒性[3-5]、免疫毒性[6-10]、器官和组织毒性[11-14]、生殖毒性[15-16]、致癌性[17]等, 因此加强对粮食作物中伏马毒素的监测和控制格外重要。

标准物质具有准确的测量标准, 可对量值溯源性、实验室的质量保证能力及监测体系进行客观评价[18]。我国对标准物质的研制起步比较晚, 尤其在生物毒素基体标准物质研制方面与国外其他国家相比仍相对落后。生物毒素基体标准物质是指基体中有确定含量的生物毒素物质。基体标准物质可以避免基质中所存在的活性物质与生物毒素产生反应, 对测定结果产生干扰。与纯品标准物质相比, 基体标准物质为目标化合物和基体结合, 与真实检测样品更一致, 可以保障测试结果的准确性和质量控制的有效性[19]。

国外伏马毒素相关的标准物质价格昂贵, 且货运期长, 购买不便, 远远不能满足国内对于伏马毒素的检测和质量控制的需求。而我国“国家标准物质资源共享平台”上暂未查到有关伏马毒素FB1 的基体标准物质, 本次试验根据JJF 1006-1994《一级标准物质技术规范》[20]、JJF 1343-2012《标准物质定值的通用原则及统计学原理》[21]以及ISO 导则[22]研制了玉米粉中伏马毒素FB1 基体标准物质, 对于实验室中玉米及其加工品中伏马毒素FB1 的检测起到准确性、可溯源性等重要作用。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂

仪器包括： 超高效液相色谱-串联四级杆质谱(UPLC-XEVO TQ, 美国Waters 公司); THZ-300 恒温培养摇床(上海一恒科学仪器公司); 台式高速冷冻离心机(德国Sigma 公司); MILLI-Q 纯水机(美国Millipore 公司);LGJ-10FD 真空冷冻干燥机(北京松源华兴科技发展有限公司); V 型混合机; 均质分离机; 涡旋混匀器; 氮吹仪;天平。

试剂包括： 甲醇、乙腈(色谱级, 美国Fisher 公司); 甲酸(色谱级, 美国 Sigma 公司); 伏马毒素标准品(美国Romer 公司)。玉米原料购买自市场。

1.2 仪器条件

1.2.1 色谱条件 色谱柱为C18柱(100 mm×2.1 mm,粒径1.6 μm); 柱温40℃; 样品温度10℃; 进样体积为5 μL; 流动相A： 甲醇(色谱级), 流动相B： 0.1%的甲酸,流速为0.2 mL min-1; FB1 梯度洗脱程序0～5.5 min 流动相A 由2%增加至85%, 5.5～5.6 min 流动相A 降至2%, 平衡2.4 min。

1.2.2 质谱条件 电喷雾离子源(electrospray ionization, ESI), 正离子模式; MRM 多反应监测模式; 毛细管电压2.50 kV; 离子源温度110℃; 去溶剂气流量800 L h-1;溶剂气温度为450℃。

1.3 标准物质的研制

将所购玉米颗粒进行伏马毒素 FB1 毒素含量初检,符合要求后按照一定比例添加一定浓度伏马毒素FB1 标准溶液, 经浸泡使之达到预期含量, 之后将样品冷冻干燥、磨细粉, 过40 目筛, 充分混匀并分装, 抽真空密封保存。

1.4 均匀性检验

均匀性是标准物质最基本的属性, 是标准物质研制能顺利进行的基础。按照 JJG 1006-1994[20]和 JJF 1343-2012[21]中的相关规定, 从制得的200 袋样品中随机抽取15 袋, 进行单元间均匀性检测, 每袋平行测定3 次,进行单元内均匀性检测。样品最小取样量为2.0 g, 用超高液相色谱串联质谱法检测, 对检测结果进行单因素方差(F检验法)分析, 评价样品的均匀性。

1.5 稳定性检验

依据JJG 1006-1994[20]和JJF 1343-2012[21]的规定, 按照先密后疏的原则进行样品运输过程中的短期稳定性考察和储存过程中的长期稳定性考察。在44℃条件下, 于0、1、4、7、14 d 检测样品中的FB1 毒素含量, 考察样品的短期稳定性; 在4℃和−18℃条件下, 于0、1、2、4、6月分别检测样品的FB1 毒素含量, 考察样品的长期稳定性。每次检测随机取3 袋标准物质样品, 每一袋样品平行测定2 次, 取2 次数据的平均值作为最终检测结果。所用检测方法与均匀性检验保持一致。

对测定结果采用趋势分析法进行分析, 以此来考察线性关系的斜率随样品稳定性变化的变化值, 用该变化值对标准物质的稳定性进行评价,拟合直线Y=b0+b1X,X表示稳定性考察时间,Y表示标准物质的特性值,b0、b1表示回归系数, 若|b1|＜t0.95, n-2·s(b1), 说明斜率无显著性变化,该标准物质在监测时间内能够保持稳定。该拟合直线的斜率计算公式为：

截距计算公式为：

直线标准偏差计算公式为：

斜率的不确定度计算公式为：

1.6 标准物质定值和不确定度

标准物质定值依据《标准样品定值的一般原则和统计方法》[23]的要求, 本次标准物质的定值采取6～8 家实验室联合测定的方法, 所选定的实验室均为国内权威检测机构且具有伏马毒素检测资质的实验室。各实验室均按照GB 5009.240-2016《食品安全国家标准食品中伏马毒素的测定》进行检测。将各实验室的组间数据经格拉布斯(Grubbs)检验进行可疑值剔除, 科克伦(Cochran)法检验实验室间数据是否为等精度数据, 狄克逊(Dixon)法检验实验室间数据是否有离群值。计算出符合条件的实验室数据的平均值, 该平均值即为样品的定值结果。

依据《不确定度评估指南》[24]和GB/T 15000.3-2008[25]的方法, 标准物质的不确定度主要由3 个方面组成, 即均匀性引起的不确定度ubb、稳定性引起的不确定度us、定值过程中引入的不确定度uchar。其中稳定性不确定度us包括短期稳定性不确定度usts和长期稳定性不确定度uIts。

2 结果与分析

2.1 均匀性检验结果

采用单因素方差分析法进行与单元内的均匀性检验,F为单元间方差与单元内方差的比值, 与在95%置信水平下的临界值Fα比较大小, 若F值小于Fα, 则认为样品间无显著性的差异, 均匀性好。本文Fα为F0.05(14,30)= 2.04, 检验结果由表1 可知,F＜F0.05(14,30), 说明玉米粉中FB1 样品均匀, 能满足标准物质均匀性要求。

2.2 稳定性检验结果

表2 为玉米样品在44℃环境下保存14 d 所测数据,由表2 可知, 玉米样品在14 d 内所计算出|b1|＜t0.95,n-2·s(b1),且由图1 所示, 直线拟合方程的斜率不显著, 因此该标准物质在44℃模拟运输环境下可以保持稳定。

表1 玉米粉中伏马毒素FB1 均匀性检验结果Table 1 Test results of homogeneity of Fumzonisins FB1 in corn flour (μg kg-1)

表2 玉米粉中伏马毒素FB1 短期稳定性检验结果Table 2 Short-term stability test results of Fumonisins FB1 in corn flour (μg kg-1)

图1 玉米粉中伏马毒素FB1 短期稳定性趋势分析图Fig. 1 Analysis chart of short-term stability trend of Fumonisins FB1 in corn flour

表3 为标准物质在4℃和−18℃条件下储存6 个月, 分别在1、2、4、6 个月时对样品用UPLC-MS/MS 进行伏马毒素含量检测, 取样方法、数据处理与短期稳定性检验一致, 由表3 可知, 该标准物质在6 个月时间范围内|b1|＜t0.95,n-2·s(b1), 且由图2 所示, 该标准物质的拟合直线斜率不显著, 即玉米粉中伏马毒素FB1 含量无明显增加或减少,因此可认为该标准物质在4℃、−18℃温度下可以较好地储存6 个月。

2.3 定值和不确定度分析

本批标准物质由多家实验室采用指定检测方法进行联合定值, 为每家实验室随机分发两袋样品, 对每袋样品至少平行测定3 次, 最终每家实验室提供6 组数据。将所有实验室所测数据汇总并分析, 每个实验室的组内数据经狄克逊准则检验是否有异常值, 各实验室的定值数据经格拉布斯检验进行统计分析, 采用科克伦准则判断数据有无可疑值, 最终有6 家实验室的数据被采用(表4), 将所保留的最终数据计算出平均值, 即为最终的定值结果。

表3 玉米粉中伏马毒素FB1 长期稳定性检验结果Table 3 Long-term stability test results of Fumonisins FB1 in corn flour (μg kg-1)

图2 玉米粉中伏马毒素FB1 长期稳定性趋势分析图Fig. 2 Analysis chart of long-term stability trend of Fumonisins FB1 in corn flour

2.4 标准物质的不确定度

2.4.1 均匀性不确定度

2.4.2 稳定性引入的不确定度

短期稳定性不确定度usts=s(b1)·t=3.6429×14=51 μg kg-1

长期稳定性不确定度ults= 59.61 μg kg-1

2.4.3 定值引入的不确定度 标准物质定值过程中带来的A 类不确定度, 主要为联合定值过程中引入的不确定度, B 类不确定度主要为对测量产生影响的因素所产生的不确定度。

联合定值引入的不确定度uA=10.05%

测量过程中不确定度uB=1.0%

2.4.4 扩展不确定度

表4 各实验室联合定值测定结果Table 4 Results of joint determination of fixed value by various laboratories (μg kg-1)

3 讨论

本研究通过对JJF 1343-2012《标准物质定值的通用原则及统计学原理》[21]以及ISO 导则[22]的学习和研究, 制备了玉米粉中伏马毒素FB1 基体标准物质, 将购买的玉米样品经筛选, 加伏马毒素FB1 标准溶液浸泡, 冷冻干燥,磨粉, 混匀后抽真空包装制得标准物质。按照 JJG 1006-1994[20]与JJF1343-2012[21]中的有关规定, 对标准物质进行均匀性检验和为期半年的稳定性检验的研究。根据《标准样品定值的一般原则和统计方法》[23]中的要求, 选取了多家具有伏马毒素检测资质的实验室进行定值, 因毒素检测较为复杂, 且不同实验室操作环境及不同操作人员难以保证检测结果在误差范围内, 最终只有6 家实验室结果予以采用, 最后计算平均值即为标准物质的定值结果。

实验中对标准物质中的伏马毒素FB1 用超高效液相色谱-串联质谱法进行了均匀性和稳定性检验, 均匀性检验F＜F0.05(14,30), 可以证明所研制的标准物质达到了均匀性的要求, 稳定性检验分为短期稳定性和长期稳定性检验, 检验结果在置信水平p=0.95% (95%置信水平)下, 检验拟合直线斜率b1小于t0.95, n-2·s(b1), 斜率无显著性差异,因此在6 个月时间范围内, 伏马毒素FB1 稳定性良好, 符合标准物质要求。最后经联合定值得出该标准物质的特征值为1475.56 μg kg-1, 不确定度为169.98 μg kg-1。

因目前国内对于生物毒素基体标准物质研制较少,尤其基体标准物质起步更晚, 基体标准物质研制过程较为复杂, 但其与待检测样品有较高相似性, 能够避免干扰检测结果, 因此研制基体标准物质是很有必要的, 对于我国的生物毒素检测技术的提升具有重要意义。