王玉霞 孟利强 李 晶 姜 威刘宇帅 曹 旭 张淑梅

(1黑龙江省科学院微生物研究所，黑龙江 哈尔滨 150010；2黑龙江省科学院高技术研究院，黑龙江 哈尔滨 150020)

芽胞杆菌类微生物制剂具有药肥双效、环境友好特性，是农业可持续发展的重要保障。 芽胞杆菌在土壤中的繁殖能力与防效呈正相关，低温条件下菌株生长缓慢，防效下降，限制了其在低温环境中的应用[1]。近年来，国内相继开展了低温芽胞杆菌的研究，主要侧重于菌株筛选和生防效果方面[2-5]，对其低温生长机制的研究较少。

微生物的低温适冷机制涉及细胞全局性反应，包括营养吸收、基因表达、蛋白合成、能量代谢、细胞分裂等复杂过程，目前多集中于细胞膜、适冷酶和冷休克蛋白等方面[6-8]。 微生物在低温条件下可通过增加不饱和脂肪酸及支链脂肪酸的含量，降低脂肪酸链长度来提高细胞膜流动性，完成营养物质的转运和吸收[9]。此外，低温条件下微生物可产生低温酶及Csps 系列冷激蛋白提高其稳定性及生物活性[10-11]。 基因组、转录组、蛋白质组等组学技术为微生物低温适冷机制研究提供了新方法。 Ting 等[12]通过蛋白质组技术发现菌株Sphingopyxis alaskensis冷适应涉及生理代谢多个层面；Wang 等[13]通过转录组技术发现菌株Psychrobactersp.低温响应脂肪酸和ABC 转运体代谢相关基因差异表达。 目前多数研究侧重于应用组学技术研究微生物低温短暂应答机制[14-16]，对微生物低温长期生长机制的研究较少。

菌株WM7 是黑龙江省科学院微生物研究所微生物药物团队前期利用等离子体诱变技术获得的一株低温生长速度较快的甲基营养型芽胞杆菌[17]，该菌株抑菌谱广，具有一定的开发应用潜力。 本研究利用高通量测序技术对该菌株进行低温响应转录组分析，挖掘其低温生长相关基因，以期为揭示该菌株低温生长分子机制奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

甲基营养型芽胞杆菌(Bacillus methylotrophicus)WM7 是一株采用等离子体诱变技术获得的生防菌株，遗传稳定性好，低温生长速度快，可抑制多种植物病原菌生长，保存于黑龙江省生物工程重点实验室。

1.2 菌株培养

取一环冷冻保藏的WM7 菌液接种到LB 固体平板上，30℃过夜培养，次日取单菌落转接于5 mL LB 液体培养基中，30℃条件下170 r·min-1震荡培养1 d，按2%接种量转接于500 mL LB 液体培养基中，分别置于30℃和15℃震荡培养1 d，离心收集菌体并于-80℃保存备用。

1.3 RNA 提取与文库构建

采用TRNzol Reagent 试剂盒[天根生化科技(北京)有限公司]提取总RNA，经2100 Bioanalyzer(安捷伦，美国) 质检合格后，用Ribo-ZeroTMMagnetic Kit(Epicentre，美国)去除rRNA，取100 ng 样品用NEB Next © UltraTMDirectional RNA Library Prep Kit for Illumina (NEB，美国) 构建文库，经Qubit 定量、2%琼脂糖凝胶电泳及High sensitivity DNA chip 检测合格后，取10 ng 样品用Illumina HiseqTM2500/MiSeqTM进行双向测序。

1.4 测序数据分析

使用q20 质控标准去除原始数据中的低质量数据，用Bowite 2 v2.1.0 软件将Clean reads 分别比对到参考基因组和参考基因序列中，用Samtools v0.1.19软件进行表达水平分析，基因表达量的计算使用RPKM 法；利用DEGseqv1.20.0 程序包中的MARS 模型进行基因表达差异分析，同时满足倍数变化(Fold change)＞2、FDR(q 值)＜0.001、P≤0.05、至少一个样本RPKM＞20 的基因为差异表达显著基因。 将差异表达基因在GO 和KEGG 数据库中进行功能和代谢途径注释，根据差异基因的GO 和KEGG pathway 注释信息，对差异表达基因进行GO 和KEGG pathway 富集分析，以确定差异表达基因显著性富集的GO 功能分类和生化代谢途径。

1.5 差异基因RT-qPCR 验证

选取6 个低温响应差异表达基因进行RT-qPCR验证。 用FastKing gDNA Dispelling RT SuperMix[天根生化科技(北京)有限公司]试剂盒进行菌体总RNA提取和cDNA 合成，利用primer 5.0 软件设计RTqPCR 引物，以菌体16S rRNA 作内参计算基因的相对表达量。 各处理均做3 次重复。

2 结果与分析

2.1 转录组与参考基因组比对

由表1 可知，甲基营养型芽胞杆菌WM7 低温和常温培养转录组测序获得的有效reads 分别为3 523 063和3 009 005，q20 均为99.62%，这些reads 与参考基因组(甲基营养型芽孢杆菌CBMB205)基因匹配程度较高，匹配率分别为81.5%和79.5%，能够比对到基因组多个位置的Multiple match 比例较低，仅能够比对到基因组唯一位置的Unique match 大于75%，可信度较高，说明测序质量较好，可用于后续分析。

表1 两样品与参考基因组比对结果Table 1 RNA-Seq data quality of two samples compared with reference genome

2.2 基因表达量分析

由表2 可知，甲基营养型芽胞杆菌WM7 的低温和常温培养样品的基因表达量分布一致，RPKM 在10～1 000 范围内的基因最多(73.5%和70.6%)，其次是RPKM＜10 的基因(19.3%和22.9%)，RPKM＞1 000 的基因较少(0.7%和0.6%)。

2.3 差异表达基因分析

转录组测序显示，有3 758 个基因差异表达，表达量变化2～5 倍、5 ～10 倍、10 ～15 倍和大于15 倍的基因数分别为45.2%、13.9%、3.5%和6.3%，其中，2 029 个基因差异表达显著，低温条件下1 519 个基因表达上调，510 个基因表达下调，上调基因是下调基因的2.9 倍。 基因表达差异程度不均一，差异倍数在2 ～5倍的基因最多(65.4%)，其次是差异倍数5 ～10 倍和大于15 倍的基因，分别为25.87%和11.68%，差异倍数10～15 倍的基因最少(6.45%)。 差异倍数2～10 倍的上调基因是下调基因的2.5 倍，差异倍数10 ～15 倍的上调基因略多于下调基因，差异倍数大于15 倍下调基因是上调基因的2 倍(图1)。

表2 不同表达水平(RPKM)范围分布的基因数Table 2 The number of genes distributed in different expression levels (RPKM)

图1 甲基营养型芽胞杆菌WM7 低温响应差异表达基因统计分析Fig.1 Statistical analysis of differentially expressed genes of Bacillus methylotrophicus WM7 at low temperature

2.4 差异表达显著基因的GO 功能和KEGG 分析

GO 功能注释了1 199 个基因，归属于细胞组分(cellular component)、分子功能(molecular function)和生物过程(biological process)3 个部分(图2)。 低温条件下，941 个基因上调表达，258 个基因下调表达。 低温响应上调表达基因主要与转录调控、细菌趋化、脂肪酸合成、膜蛋白、能量代谢和冷适应酶等相关；下调表达基因主要与孢子形成、氧化还原作用、蛋白裂解及压力应答相关。 KEGG 分析显示，683 个差异表达基因参与到四大类20 个小类代谢通路中，其中与糖类、蛋白(含氨基酸)、脂类和核酸等四类生物大分子代谢相关的基因占差异表达基因总量的58.9%，能量代谢相关基因占9.3%，细胞运动相关基因占9.3%，信号转导相关基因占22.9%(图3)。 KEGG 显著富集到37个代谢途径，其中嘌呤和嘧啶代谢、细菌趋化、氨基酸合成、鞭毛组装、磷酸戊糖途径涉及的基因数最多。 定位到磷酸戊糖途径有25 个基因，24 个上调表达。 定位到嘌呤代谢途径有66 个基因，39 个上调表达。 定位到嘧啶代谢途径有47 个基因，35 个上调表达。 定位到细菌趋化途径和鞭毛合成途径分别有15 个和29个基因，均上调表达。 定位到氨基酸合成途径有120个基因，84 个上调表达。 以上注释信息为研究甲基营养型芽胞杆菌WM7 低温生长调控机制提供了必要的基因分子信息。

图3 甲基营养型芽胞杆菌WM7 低温响应差异表达基因KEGG 代谢通路分类Fig.3 KEGG pathway categories of differentially expressed genes of Bacillus methylotrophicus WM7 at low temperature

2.5 脂肪酸合成与膜蛋白相关基因

细胞膜是细胞与环境进行信息、物质与能量交换的重要场所。 微生物低温下可通过调节细胞膜脂组成维持膜的流动性，增加不饱和脂肪酸含量，缩短脂肪酸链长度。 由表3 可知，甲基营养型芽胞杆菌WM7 低温响应25 个脂肪酸代谢相关基因差异表达，参与脂肪酸分解代谢的7 个基因中5 个下调表达，2 个上调表达，其中乙酰-CoA 乙酰转移酶(NG74＿RS15160)、脂酰辅酶A 水合酶(NG74＿RS 13010)、乙酰-CoA 乙酰转移酶(NG74＿RS 11340)和3-羟酰基-辅酶A 脱氢酶(NG74＿RS 15165)4 个基因低温响应显著下调表达。参与脂肪酸合成代谢的18 个基因中编码β 酮脂酰ACP 合成酶Ⅱ(NG74＿RS02805)、乙酰CoA 羧化酶(NG74＿RS09255)、长链脂肪酸CoA 连接酶(NG74＿RS05145)基因下调表达，编码脂肪酸合酶系统的accA、accB、accC、accD、fabD、fabH、fabI、fabZ、fabG、fabL、fabF、MCH和Δ12-脂肪酸脱饱和酶基因均上调表达。

细胞膜膜蛋白在物质转运、信号转导、膜结构与功能维持等方面具有重要作用，膜蛋白和膜脂相互作用调节细胞膜的结构和功能。 甲基营养型芽胞杆菌WM7 低温响应46 个膜蛋白基因上调表达，19 个膜蛋白基因下调表达，上调的膜蛋白主要与信号转导、物质结合和膜结构维持相关，其中参与多糖生物合成基因NG74＿RS15990 上调表达幅度最大(9.49 倍)。

2.6 膜转运蛋白ABC 转运体与信号转导相关基因

ABC 转运体是一组跨膜蛋白，是细菌质膜上的一种运输ATP 酶，用来转运营养物质。 甲基营养型芽胞杆菌WM7 低温响应下68 个ABC 转运体基因差异表达，其中48 个上调，20 个下调，上调表达基因与核酸、糖类、甘氨酸、含硫氨基酸、金属离子、维生素转运相关，下调表达基因与多肽、谷氨酰胺转运相关。 多数基因差异表达2～5 倍，少数基因差异表达倍数较高，包括谷氨酰胺ABC 转运渗透酶基因NG74＿RS12455 和NG74＿RS12460下调9 倍和85 倍，ABC 转运渗透酶基因NG74＿RS15005下调229 倍，ABC 转运结合蛋白YxeB 基因NG74＿RS18535 上调14 倍，甘氨酸ABC 转运底物结合蛋白基因NG74＿RS15805 上调8.6 倍。

细菌通过信号转导途径实现对环境信号的应答，甲基营养型芽胞杆菌WM7 低温响应下双组分系统、FoxO、磷脂酰肌醇、MAPK、HIF-1、AMPK 和PI3K-Akt 7 个信号转导途径中的70 个基因差异表达，涉及双组分信号系统基因最多(58 个)，其中与趋化、鞭毛运动、DNA 结合应答调控、组氨酸激酶、转录调控、碳储存调控、柠檬酸盐转运、染色体复制起始、RNA 聚合酶sigD因子、苹果酸酶等相关的53 个基因上调表达，其他途径中除了FoxO 信号转导途径基因下调表达外，磷脂酰肌醇、MAPK、HIF-1、AMPK 和PI3K-Akt 信号转导途径基因均上调表达。 多数基因差异表达倍数为2 ～10 倍，9 个基因差异表达倍数大于10 倍，包括FoxO 信号途径中的过氧化氢酶基因NG74＿RS18240 和超氧化物歧化酶基因NG74＿RS18240 下调17.9 倍和20.5倍，双组分信号系统中的乙酰辅酶A 酰基转化酶基因NG74＿RS11340 下调78.7 倍，双组分信号系统途径中的组氨酸激酶传感器基因NG74＿RS01280，抗穴蛋白基因NG74＿RS13180，转录调控因子NG74＿RS01285，NDA 结合响应调控因子NG74＿RS13190 和NG74＿RS18560 以及胞壁酸水解酶调控因子NG74＿RS13185分别上调18.5 倍、18.1 倍、12.0 倍、15.1 倍、17.4 倍和66.0 倍。

转录调控因子是细胞受环境影响调控特定基因表达的重要因子[18]。 甲基营养型芽胞杆菌WM7 低温响应下93 个转录调控因子基因差异表达，包括MarR、DeoR、RpiR、 NrdR、 HxlR、 ArsR、 AsnC、 PucR、 TetR、AraC、GntR、RuBisCO、LysR、LacI、Rrf2、MerR、PadR、MntR 和Fis 家族的53 个基因和40 个其他转录调控因子，只有7 个转录因子基因下调表达，包括1 个LysR、1 个MerR 和1 个TetR 转录因子，其他转录因子均上调表达。 13 个基因差异表达倍数大于10 倍，转录调控因子NG74＿RS15950 和NG74＿RS16045 及产孢转录调控因子NG74＿RS17 090 分别表达下调144.9 倍、18.6 倍和58.6 倍，HxlR、ArsR、AsnC、MarR、Fis、XRE和LysR 家族转录调控因子NG74＿RS01680、NG74＿RS19060、NG74 ＿RS02080、NG74 ＿RS03545、NG74 ＿RS04130、 NG74＿RS11305、NG74＿RS17480 和NG74＿RS01740 分别表达上调36.0 倍、11.7 倍、34.3 倍、15.0 倍、40.5 倍、16.8 倍、15.3 倍和13.4 倍，转录调控因子NG74＿RS16925、NG74＿RS18195 和NG74＿RS06 005 分别表达上调26.6 倍、15.0 倍和13.1 倍(表3)。

2.7 适冷酶及冷适应蛋白相关基因

产生适冷酶和冷适应蛋白是菌株低温适应的重要机制之一。 甲基营养型芽胞杆菌WM7 低温响应下碳氮代谢中的一些酶和冷适应蛋白基因差异表达。 参与碳代谢的三羧酸循环途径中的13 个酶基因上调表达2.5 ～17.6 倍，3 个关键酶:柠檬酸合成酶NG74＿RS13300、异柠檬酸脱氢酶NG74＿RS13295 和α 酮戊二酸脱氢酶NG74＿RS04 035 分别上调2.8 倍、3.0 倍和2.5 倍，琥珀酸辅酶A 连接酶NG74＿RS07975 和NG74＿RS07980 上调表达显著，分别上调9.5 倍和17.6 倍。 参与磷酸戊糖途径的20 个酶基因上调表达2.8～13.4 倍，其中葡糖糖酸激酶NG74＿RS15920、6-磷酸己酮糖异构酶NG74＿RS01670、葡萄糖6 磷酸脱氢酶NG74＿RS11195、核糖激酶NG74＿RS16835 和6 磷酸葡萄糖酸脱氢酶NG74＿RS11200 基因上调表达显著，分别上调10.6 倍、13.4 倍、11.6 倍、8.12 倍和8.8倍。 参与糖酵解途径的ATP 依赖型6-磷酸果糖激酶NG74＿RS13340、葡萄糖6 磷酸异构酶NG74＿RS14405、磷酸甘油酸酯激酶NG74＿RS15865 基因分别上调4.5倍、4.7 倍和2.2 倍。 参与氮代谢的谷氨酸脱氢酶基因NG74＿RS10670 和NG74＿RS17770 分别上调6.8 倍和231.1 倍，参与氨基酸代谢的天冬氨酸氨甲酰转移酶基因NG74＿RS07670 上调248 倍。 参与DNA 复制与修复的RNA 聚合酶基因NG74＿RS04785 与RNA 解旋酶基因NG74＿RS03670 均上调4.4 倍。 冷适应蛋白NusA(NG74＿RS08235)和NusG(NG74＿RS11155)、RecA(NG74＿RS08405)、IF-2(NG74＿RS08250)、Hpr(NG74＿RS16345)、半光氨酸合成酶(NG74＿RS12360)和磷酸丙糖异构酶基因(NG74＿RS15860)上调表达2.5～13.7 倍(表3)。 以上适冷酶和冷适应蛋白基因上调表达，可提高酶在低温条件下的催化效率和蛋白活性，维持菌体细胞正常的生命活动，增强菌株低温适应性。 此外，转录组分析发现397 个未知功能蛋白基因差异表达，其中11 个基因差异表达大于50 倍。

2.8 差异表达基因的RT-qPCR 验证

6 个差异表达显著基因NG74＿RS02480(Δ12-脂肪酸脱饱和酶)、NG74＿RS13300(柠檬酸合成酶)、NG74＿RS15920(葡萄糖酸激酶)、NG74＿RS10670(谷氨酸脱氢酶)、NG74＿RS0825(转录起始因子IF-2)和NG74＿RS08235(转录终止因子NusA)的RT-qPCR 结果与表达谱分析的表达变化趋势相同，但表达差异倍数存在差异(图4)，说明基因表达谱的分析结果可靠。

3 讨论

温度是影响细菌生长的重要因素之一，细菌的冷适应涉及细胞膜、酶和蛋白，碳氮及能量代谢，转录调控，信号转导等多方面的变化。 转录组能够从整体水平上研究基因功能及结构，揭示特定生物学过程中的分子机理[19]，已被用于细菌冷适应分子机制的研究。Wang 等[13]对菌株Antarctic psychrotrophic低温响应转录组分析发现，大量转录调控因子、ABC 转运体和脂肪酸代谢相关基因差异表达。 Phadtare 等[20]对大肠杆菌冷胁迫下的转录组分析发现，大量的转录调控和能量代谢基因差异表达。 本研究首次对甲基营养型芽胞杆菌WM7 进行低温响应转录组学研究，发现2 029个(53.9%)基因低温响应差异表达，其中上调基因是下调的3 倍，GO 功能注释了1 199 个(59.0%)基因，683 个(56.9%)基因参与KEGG 代谢，大量与代谢、细胞运动、信号转导、膜转运、转录调控、DNA 复制与基因修复相关的基因差异表达，分布在20 个小类代谢途径中，其中531 个基因表达上调，152 个基因表达下调，说明该菌株低温响应是由多基因参与的系统调控过程。

细胞膜是细菌重要的温度敏感元件，低温胁迫下可通过提高细胞膜不饱和脂肪酸含量以维持膜的流动性。 不饱和脂肪酸由2 种途径合成，一种是由短链饱和脂肪酸在一系列的脂肪酸延长酶与脂肪酸脱饱和酶交替作用下合成；另一种是通过PKS 酶系合成，包括酮脂酰ACP 合成酶、酮脂酰ACP 还原酶、烯脂酰ACP脱水酶和烯脂酰ACP 还原酶[21-22]。 本试验结果表明，甲基营养型芽胞杆菌WM7 低温响应下大量脂肪酸代谢相关基因差异表达，其中不饱和脂肪酸合成相关酶基因，包括Δ12-脂肪酸脱饱和酶、烯脂酰ACP 还原酶fabI 和fabL、β-酮脂酰ACP 还原酶、烯脂酰ACP脱水酶、3-酮脂酰ACP 还原酶和3-酮脂酰ACP 合成酶基因均上调表达，说明甲基营养型芽胞杆菌WM7低温下提高了不饱和脂肪酸合成能力，可通过增加细胞膜中不饱和脂肪酸含量来稳定细胞膜功能，使其在低温条件下能够正常生长繁殖。

细菌低温下基因表达模式的改变因菌株而异，大肠杆菌在冷胁迫下参与糖酵解、三羧酸循环、氨基酸合成途径的一些酶基因的表达被抑制[20]。 而本研究中，甲基营养型芽胞杆菌WM7 低温响应下参与碳氮和氨基酸代谢的一些酶基因上调表达， 推测该菌株在低温条件下可通过提高细胞的基础代谢来维持菌株的快速生长。 冷适应蛋白参与转录、翻译、蛋白折叠等各种代谢活动，CspS 系列冷适应蛋白广泛存在于枯草芽胞杆菌、大肠杆菌等细菌中，低温条件下高表达[23-24]，甲基营养型芽胞杆菌WM7 低温响应下未发现这类蛋白差异表达，说明这类蛋白对该菌株低温生长的影响不显著。

磷酸戊糖途径和糖酵解途径是细菌中普遍存在的葡萄糖降解途径，磷酸戊糖途径可以产生大量的NADPH，为细胞的各种合成反应提供还原剂，其中间产物是许多物质(核苷酸、芳香族氨基酸等)的合成原料。 糖酵解途径产生ATP 和丙酮酸，为细胞活动提供能量。 三羧酸循环是生物体利用糖、脂肪、蛋白等物质氧化获得能量的重要途径，其代谢中间产物与其他代谢途径发生联系和相互转变。 本试验中，甲基营养型芽胞杆菌WM7 低温响应下磷酸戊糖途径中24 个基因上调表达，其关键酶基因——葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因上调12 倍；糖酵解途径中3 个关键酶基因(ATP 依赖型6-磷酸果糖激酶、葡萄糖6 磷酸异构酶、磷酸甘油酸酯激酶)上调表达，三羧酸循环中13 个基因上调表达，说明菌株WM7 低温响应下可通过强化磷酸戊糖途径、糖酵解途径和三羧酸循环为其生长提供能量和物质。

本试验结果表明，甲基营养型芽胞杆菌WM7 低温响应下大量ABC 转运体、转录调控因子和信号转导因子相关基因差异表达，且多数上调，推测菌株WM7感受低温刺激后增强转录因子调控、信号转导和物质转运能力，以维持菌株低温快速生长需求。 ABC 转运体基因差异表达是细菌低温响应的共性体现，Flavobacterium psychrophilum[25]和Antarctic psychrotrophic[13]低温胁迫下ABC 转运体基因也差异表达，涉及的基因数量低于甲基营养型芽胞杆菌WM7。 信号转导因子中涉及最多的是双组分信号转导因子，其中有13 个细菌趋化因子基因上调表达。 细菌趋化是细胞最基本的生理反应[26]，对细菌趋利逐弊十分重要[27-28]。 甲基营养型芽胞杆菌WM7 低温响应下细菌趋化和鞭毛合成途径中包括组氨酸蛋白激酶CheA、跨膜的甲基化受体趋化蛋白MCP、CheY-P 特异磷酸酶CheC、趋化蛋白甲基转移酶CheR、嘌呤结合蛋白CheW、趋化蛋白调控因子CheV、化学感受器谷氨酰胺脱氨酶CheW 和鞭毛运动蛋白Mot A/B 等44 个基因均上调表达，说明菌株WM7 低温下其趋化活性增强，利于其摄取营养物质，增强低温适应性。 菌株WM7 趋化系统中除了调控因子CheV，其他趋化因子与大肠杆菌趋化系统一致[29-31]，该调控因子的具体功能有待进一步研究。 此外，本研究发现较多表达量上调和下调15 倍以上的未知功能基因，说明甲基营养型芽胞杆菌WM7 低温响应还存在其他调节机制，对于这些基因的低温应答机制目前还是空白，后续需要进一步深入研究。

4 结论

本研究采用高通量测序技术对生防菌株甲基营养型芽胞杆菌WM7 进行低温响应转录组分析，发现2 029 个差异表达基因，其中1 519 个低温上调，510 个低温下调。 GO 和KEGG 分析明确了菌株低温响应主要与脂肪酸代谢、ABC 转运体、转录调控、信号转导、碳氮代谢相关。 RT-qPCR 分析表明，6 个差异表达显著基因表达特点与转录组测序结果一致。 本研究结果为全面揭示菌株WM7 低温生长机制奠定了理论基础并提供了基因信息。