张思宇 祁小旭 张玲玲 刘红梅 杨殿林 王 慧

(1农业农村部环境保护科研监测所， 天津 300191；2沈阳农业大学植物保护学院， 辽宁 沈阳 100161)

随着人类活动和工业的发展，土壤重金属污染问题日益严峻[1]。 目前我国农田土壤重金属严重超标，据统计，耕地土壤的点位超标率达19.4%[2]，受镉(Cd)、汞(Hg)、砷(As)、铬(Cr)、铅(Pb)污染的耕地面积约20×107hm2[3]。 黄顶菊(Flaveria bidentis)为菊科黄顶菊属一年生菊科杂草，原产于南美洲，于2001年传入我国河北、天津等地，对该地区的农业生态系统造成了极大的破坏，包括与周围植物争水、争肥和争空间等，大幅度降低了作物产量[4]。 黄顶菊还具有较强的侵略性和排他性，其适应性广，入侵环境极为复杂，农田是其主要入侵生境之一，约占黄顶菊主要发生面积的17%，玉米、棉花、菜地和果园等管理粗放地是黄顶菊多发区域[5]。 研究发现，我国典型农田土壤Cd、Hg、As 等重金属含量均高于背景值，且Cd 的潜在危害程度最高[6]。 因此，研究黄顶菊对重金属Cd 污染生境的耐受性可为预测该入侵种在农田潜在的分布扩散范围和制定防控策略提供一定的理论依据。

外来植物能够快速适应新入侵环境的各种非生物和生物条件变化是其实现成功入侵的前提[7]。 表观遗传学是环境适应性获得的重要基础，外界环境诱导的表型变异涉及表观遗传学控制基因表达的过程，且这种变异的表观遗传信息可传递给后代[8-10]。 胞嘧啶的第5 位碳原子和甲基间发生共价结合，称为5-甲基胞嘧啶(5-Me C)，是植物基因组DNA 的一种主要表观遗传修饰方式，目前在表观遗传学领域研究最为广泛，在植物基因表达、基因组防御以及系统发育中起着重要的调节作用[11]。 植物可以通过基因组DNA 甲基化变化控制其相关抗逆基因的表达，进而适应新环境[12]。 表型可塑性是指物种本身遗传多样性水平可能较低，但可通过产生不同表型以适应不同的环境，是物种在特定环境下产生较高适合度的一种表现形式[13]。 植物适应性反应和表型可塑性变异发生均涉及到基因组表观遗传变异[14]。

前人对黄顶菊的研究多集中于不同环境条件下黄顶菊种子萌发特性、形态、化感效应强弱及生理生化指标变化规律等方面[15-18]，很少关注生态适应性机理方面的研究。 DNA 表观遗传学方法为深入理解入侵性的分子遗传学基础提供了重要工具，也为了解植物入侵性发生机制提供了新思路。 遗传变异在研究入侵植物与环境的相互作用以及物种的适应性进化中具有重要作用[19]。 此外，植物也可以通过发生甲基化在基因组序列不变的情况下调控基因表达，调节表型可塑性变异来响应环境条件的变化[14]。 然而DNA 表观遗传多样性变异是否是黄顶菊对重金属和复杂盐碱生境适应性获得的潜在机制，还有待进一步研究。 本研究采用网室试验，人工模拟天津地区农田Cd 污染生境，探讨在重金属污染下黄顶菊表观遗传多样性变化特征，以期为入侵植物黄顶菊的防控提供一定的理论指导。

1 材料与方法

1.1 试验材料

黄顶菊种子采自天津静海团泊水库，为2016 年收获的新种。 试验在农业农村部环境保护科研监测所网室(39°05′N，117°08′E)内进行，供试土壤类型为潮土，装盆前统一过筛，将过筛后的土壤与CdCl2·2.5H2O粉末混匀(土壤中Cd 含量为土壤本底含量＋处理添加含量)，确保盆中土壤粒径均匀，平衡2 个月后备用，供试土壤理化性质详见表1。

表1 供试土壤基本理化性状Table 1 The main fertility characteristics of the soil used in the experiment

1.2 试验设计

2017 年4-9 月开展网室盆栽试验，采用直径25 cm，高35 cm 的塑料花盆，每盆装土7.5 kg。 选择健康饱满的黄顶菊种子播种于育苗盘上，培养至2 ～3 片真叶，选择长势一致的幼苗移栽至花盆中，每盆定苗2株。 设4 个不同Cd 浓度[0(CK)、2(Cd-1)、4(Cd-2)和8(Cd-3) mg·kg-1]胁迫处理，每个处理10 次重复，每个重复2 个单株。 基肥中N 含量为175 mg·kg-1，P2O5含量为120 mg·kg-1，K2O 含量为50 mg·kg-1。各处理每2 d 浇1 次水，每15 d 随机转盆一次以消除局部环境条件差异的影响。

1.3 植物样品采集

2017 年8 月20 日，于黄顶菊生长盛期(胁迫处理61 d)每处理随机选取3 株植株，采集第4～第6 对完全展开叶片，用锡箔纸包裹迅速用液氮速冻后，-70℃保存备用，用于后续DNA 甲基化及酶活指标的测定。 2017年9 月中旬，采集整株植株用于生长指标、重金属富集与转移等指标的测定，并计算其表型可塑性指数。

1.4 基因组DNA 提取与测定

采用改良CTAB 法[20]提取黄顶菊叶组织基因组DNA，并用Nano Drop 2000 核酸蛋白分析仪(基因有限公司，中国香港)测定DNA 浓度。

1.5 MSAP 体系建立与优化

甲基化敏感扩增多态性(methylation sensitive amplification polymorphism， MSAP)体系建立与优化参照全志星等[21]方法，并加以改进。EcoRⅠ/HpaⅡ和EcoRⅠ/MspⅠ双酶切、预扩增及选择性扩增各步骤中所用接头和引物序列详见表2。

表2 本研究中接头和引物序列信息Table 2 Sequence information of adaptor and primers used in this study

1.6 聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染

1.6.1 样品前处理 取8 μL 选择性扩增产物于95℃变性7 min，取5 μL 变性产物与2 μL 10×Loading buffer 混匀离心，置于冰上冷却5 min。

1.6.2 5% PAGE 凝胶制备 尿素(分析纯)33.6 g，5×TBE 16 mL，40%丙烯酰胺贮液(19 ∶1，v/v)10 mL，超纯水20.4 mL，N，N，N′，N′-四甲基乙二胺(N，N，N′，N′- tetramethylethylenediamizne， TEMED) 75 μL 和10% 过硫酸铵(ammonium persulfate， APS) 320 μL 于灌胶前加入，均匀搅拌并迅速灌胶，约2 h 胶完全凝固后进行垂直电泳。

1.6.3 垂直电泳 55 W 恒定功率下预电泳30 min使胶面温度达55℃，取样品6 μL 点样，继续电泳2 h对选择性扩增产物做进一步分离。

1.6.4 银染 电泳结束后剥离2 块玻璃板，将带有凝胶的长玻璃板置于染液(4 g AgHNO3、30 mL 37%甲醛溶于1 L 去离子水)中染色2 min，再放入30% NaOH溶液中进行显色至条带完全显现，用清水缓慢冲洗晾干用于后续条带分析。

1.7 数据统计与分析

用Quantity One 软件统计甲基化敏感扩增多态性图谱在100 ～800 bp 区间的条带，并转换成表型数据0/1 矩阵，用POPGene 软件分析引物组合的表观遗传多样性指数，采用Origin 9.1 绘图，并采用SPSS17.0统计软件进行差异显著性检验，Pearson 法进行表型可塑性与甲基化水平的相关性分析，甲基化带型分类参照潘雅姣等[22]的方法。 甲基化模式类型详见表3。

表3 MSAP 甲基化模式类型Table 3 MSAP methylation pattern types

2 结果与分析

2.1 植物叶片DNA 提取及MSAP 体系建立

模板DNA 的OD260/OD280值均在1.7 ～1.9 之间，且DNA 条带清晰完整，无拖尾现象，说明DNA 纯度较高，无大分子蛋白质等杂质，可用于后续酶切连接(图1-A)；产物无主条带，且呈刷状，说明酶切充分可进行预扩增反应(图1-B)；条带整体呈弥散状，且少许亮带集中在150～800 bp 之间，可用于后续选择性扩增(图1-C)；片段在150 ～800 bp 之间的条带较亮，无拖尾现象，且重复性较好，可进行下一步反应(图1-D)。

2.2 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测

选择性扩增产物通过5%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，获得甲基化MSAP 图谱。 部分引物的MSAP扩增结果，条带清晰且均匀，可用于后续甲基化条带统计与分析(图2)。 利用Quantity One 软件统计重金属胁迫下黄顶菊叶片甲基化扩增条带(表4)，筛选出的15 对引物共扩增出726 条条带，平均每对引物约扩增出49 条条带，其中，引物EhHM2 扩增条带数最多，为66 条；引物EhHM7 扩增的条带数最少，为28 条。 引物组合EaHM13 扩增条带的多态性百分比最高，为96.55%，表明引物EaHM13 对黄顶菊表观遗传变异贡献率最大；引物EhHM7 扩增条带的多态性百分比最低，为75.00%，表明引物EhHM7 对黄顶菊表观遗传变异贡献率最小。

2.3 Cd 胁迫对黄顶菊叶片DNA 甲基化的影响

由图3 可知，黄顶菊叶片半甲基化、全甲基化和整体甲基化的发生比例均随着Cd 胁迫浓度的增加呈逐渐增加的趋势。 其中各处理间半甲基化的发生比例差异不显著；Cd 胁迫处理的全甲基化发生比例均显著高于CK，Cd-1、Cd-2 和Cd-3 全甲基化发生比例分别为CK 的1.51、1.95 和2.11 倍；Cd 胁迫处理下整体甲基化发生比例也均明显高于CK，Cd-1、Cd-2 和Cd-3 处理组整体甲基化发生比例分别为37.52%、41.30 和44.17%，分别较CK 升高了39.28、53.30 和63.97 个百分点，其中Cd-2 和Cd-3 处理组整体甲基化发生比例显著高于CK。

图1 Cd 处理下黄顶菊叶片MSAP体系琼脂糖凝胶电泳图Fig.1 Agarose gel electrophoresis of MSAP system of leaves of Flaveria bidentis under Cd treatment

图2 引物EaHM13 对Cd 处理下黄顶菊叶片DNA的MSAP 扩增图谱Fig.2 DNA MSAP amplification patterns of leaves of Flaveria bidentis under Cd treatment by primer EaHM13

表4 Cd 胁迫下黄顶菊叶片引物组合的序列信息及扩增条带数Table 4 Sequence information and the number of bands amplified by primer combination of Flaveria bidentis under Cd stress

2.4 Cd 胁迫下黄顶菊叶片DNA 甲基化状态变化

由表5 可知，利用MSAP 法分析Cd 处理下黄顶菊叶片基因组DNA 可能出现的甲基化状态变化共有13种。 其中A、B、C、D 类均为与重金属胁迫相关的甲基化条带类型，而E 类为无变化带型。 Cd-1、Cd-2、Cd-3 处理下黄顶菊去甲基化类型位点数分别为91、87 和92，分别占基因组DNA 总扩增位点的14.15%、13.16%和13.65%；重新甲基化类型位点数分别为158、169 和165，分别占基因组DNA 总扩增位点的24.57%、25.57%和24.48%；不定类型位点数分别为63、74 和74，分别占基因总扩增位点的9.80%、11.20%和10.98%。 表明，在不同浓度Cd 胁迫下黄顶菊叶片基因组DNA 发生甲基化变异位点占总扩增点位均依次表现为重新甲基化类型＞去甲基化类型＞不定类型，均以重新甲基化为主要变异类型。

2.5 黄顶菊各指标表型可塑性指数与表观遗传的相关性分析

图3 不同浓度Cd 胁迫下黄顶菊叶片各甲基化类型发生比例Fig.3 Proportion of methylation types in Flaveria bidentis leaves under different concentrations of Cd stress

黄顶菊各指标表型可塑性指数的数据来源于前期试验研究(未公布)。 由于表观遗传变异是表型可塑性和适应性反应发生的重要分子基础，故进一步将黄顶菊各指标表型可塑性指数与甲基化水平做相关性分析。 由表6 可知，黄顶菊叶片DNA 全甲基化水平与总生物量和地上部耐受性指数呈显著负相关(P＜0.05)，与超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性、过氧化物酶(peroxidase，POD) 活性、过氧化氢酶(catalase，CAT)活性、丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量、根组织Cd 含量、茎组织Cd 含量、叶组织Cd 含量、地上部富集系数、根部富集系数及转移系数呈极显著正相关(P＜0.01)；黄顶菊叶片整体甲基化水平与根长、总生物量及地上部耐受性指数呈显著负相关(P＜0.05)，与地上部富集系数呈显著正相关(P＜0.05)，与SOD 活性、POD 活性、CAT 活性、MDA 含量、根组织Cd 含量、茎组织Cd 含量、叶组织Cd 含量、根部富集系数及转移系数呈极显著正相关(P＜0.01)。 上述结果表明， 黄顶菊在生长发育过程中， 主要发生5′-CCGG-3′胞嘧啶内侧全甲基化和5′-CCGG-3′胞嘧啶内侧外侧全甲基化2 种变异，即DNA 全甲基化和整体甲基化水平升高，以增强Cd 胁迫下保护酶系统的表型可塑性及各组织对Cd 的富集与转移能力，从而提高其耐受性；DNA 全甲基化和整体甲基化水平升高的同时可能抑制某些与植物生长发育相关基因的表达，导致其生物量与地上部耐受性降低。

3 讨论

研究表明，在外界环境的刺激下植物会产生表观遗传上的变异，DNA 甲基化是表观遗传的一种作用方式，其可在不改变基因组序列的情况下调节植物的生长发育[23]。 基因的表达与甲基化水平密切相关，基因处于表达状态时甲基化水平相对较低，而当其受到逆境胁迫或者生长发育需要时，其启动子区域或者编码区会发生重新甲基化来终止基因表达[24]。 植物调控甲基化的方式一般有2 种，一是通过体内的甲基转移酶控制甲基转移到各种化合物上发生甲基化；二是在逆境条件下，发生氧化胁迫产生大量甲基自由基对胞嘧啶进行取代，对DNA 造成损伤形成甲基化[25-26]。研究发现，植物体内普遍存在胞嘧啶甲基化现象，植物体内有6%～25%的胞嘧啶会发生甲基化修饰的现象，且同一植物的不同器官及同一器官的不同发育阶段胞嘧啶甲基化水平也存在差异[27-29]。 逆境胁迫也会影响植物的甲基化水平，环境刺激会诱导植物的甲基化多态性，如葛才林等[30]研究发现0.025～0.1 mmol·L-1的重金属Cd2＋、Cu2＋和Hg2＋会提高小麦或者水稻叶片DNA 中的5-甲基胞嘧啶含量；过量的Cd2＋会抑制种子萌发及幼苗生长，且会导致植物膜脂过氧化，产生大量活性氧，进而改变整体甲基化水平[31]；重金属Cr6＋能提高小麦根部DNA 胞嘧啶甲基化水平，从而影响其生长发育[32]。 本研究中，黄顶菊在不同Cd 浓度胁迫下半甲基化水平、全甲基化水平及整体甲基化水平均随着Cd 胁迫浓度的升高呈逐渐增加的趋势，且全甲基化和整体甲基化水平显著增加。

表5 不同浓度Cd 胁迫下黄顶菊叶片甲基化状态变化Table 5 Changes of methylation status of Flaveria bidentis leaves under different concentrations of Cd stress

植物主要通过重新甲基化和去甲基化2 种模式调节其基因表达，体内甲基化模式的改变，是抵御逆境胁迫的一种保护方式[33]。 殷欣[34]研究发现大豆在重金属Cd 处理下，其DNA 甲基化模式的改变主要以发生重新甲基化为主，基因组DNA 可能通过甲基化关闭某些相关基因的表达并抑制转录，从而增强机体对不良环境的抵抗；杨金兰等[35]研究发现，在重金属Cd 胁迫下萝卜主要通过重新甲基化模式启动对胁迫的能动应激机制，降低Cd 的毒害作用。 本研究中在2、4 和8 mg·kg-1Cd 浓度胁迫下黄顶菊DNA 重新甲基化的发生位点数分别占基因总扩增位点的24.57%、25.57%和24.48%，而去甲基化类型位点数仅占基因组DNA总扩增位点的14.15%、13.16%和13.65%，以发生重新甲基化类型为主，其原因可能是黄顶菊在重金属Cd胁迫下通过发生DNA 重新甲基化关闭某些基因的表达，或对黄顶菊造成了氧化胁迫，导致其特定位点发生甲基化，这与前人研究结果一致[36]。

表6 黄顶菊各指标的表型可塑性与甲基化水平的相关性Table 6 Correlation between phenotypic plasticity and methylation level of various indexes of Flaveria bidentis

表型可塑性会影响外来入侵植物的形态和地理分布特征，这也是其蔓延扩张的重要机制，是表观遗传学研究重要的一部分，表型可塑性越强，其资源获得性就越强，植物适应新环境的能力也越强[13，37]。 本研究中，黄顶菊各生长指标和地上部耐受性指数的表型可塑性指数与叶片全甲基化水平和整体甲基化水平均呈负相关，其原因可能是甲基化水平的增强关闭了某些基因的表达，从而抑制了黄顶菊的生长；Karan 等[38]研究发现基因组甲基化水平发生变化的同时也会影响其他调节机制的功能。 本研究中抗氧化酶活性、植株各组织内Cd 含量及富集系数与转移系数的表型可塑性与甲基化水平呈正相关，表明甲基化水平的增强可能减弱逆转录转座子修饰或转录因子的调控作用，从而增强其调控的抗氧化酶活性及对Cd 的转移能力。

4 结论

本研究结果表明，重金属Cd 胁迫下黄顶菊叶片的甲基化水平与模式均发生了变化，Cd 浓度的增加会诱导甲基化水平的升高，且主要发生重新甲基化模式变化；黄顶菊对Cd 污染生境具有一定的耐受性，黄顶菊主要通过调节保护酶系统的表型可塑性及各组织对Cd 的富集与转移能力来提高其耐受性，而DNA 全甲基化和整体甲基化水平升高引起的生长指标表型可塑性的降低导致植物生长和生物量积累的减弱，为该生境下黄顶菊的适应性生长提供基础理论依据，但其叶片甲基化变异发生的具体基因位点及对重金属生境的适应性的详细机制仍需进一步研究。