冯睡 尹金淑 谢洪 姬巍 刘艾竹 彭洪

鼻咽癌为发生于鼻咽腔侧壁和顶部的一种高发性恶性肿瘤，其发病率在耳鼻咽喉各类恶性肿瘤中居于首位。鼻咽癌的发生发展与饮食习惯、遗传易感性、环境、理化因素、EB 病毒感染等因素有关，并且是一个多步骤、多基因参与的复杂过程[1]。鼻咽癌侵袭转移是患者预后不佳乃至死亡的主要因素，多数转移为颈部淋巴结转移。表皮生长因子样结 构 域7（epidermal growth factor-likedomain 7，EGFL7）表达于血管内皮系统，在生理或病理性血管管腔形成、功能维持等过程中发挥重要作用，近年来研究发现EGFL7 在一些肿瘤细胞中也有表达[2-3]。肿瘤转移相关基因（metastasis-associated gene1，MTA1）为近年来研究较多的与肿瘤浸润转移相关的基因，其在多种肿瘤细胞系中表达，并与肿瘤的侵袭转移关系密切[4-5]。针对鼻咽癌缺乏特异性、敏感性高的标志物的情况，本研究对鼻咽癌患者血清EGFL7、MTA1表达情况和与患者临床特征及预后的进行了探究，以期为鼻咽癌患者的临床诊疗及预后评估提供有效指示指标。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取本院2014年1月至2016年1月收治的鼻咽癌患者病理组织60例，其中男37例，女23例，平均（52.6±3.7）岁，病理分期：Ⅰ期4例，Ⅱ期17例，Ⅲ期28例，Ⅳ期11例；淋巴结转移：无38例，有22例；浸润深度：T1～226例，T3～434例；分化程度：低11例，中29例，高20例；EB 病毒相关抗体阴性24例，阳性36例。根据鼻咽癌患者是否存在淋巴结转移，分为转移组和未转移组，并以同期20例正常鼻咽部组织作为对照组，其中男12例，女8例，平均（51.5±4.4）岁。

纳入标准：①均经病理学检查确诊；②均为首次确诊，未接受放化疗或其他抗肿瘤治疗；③卡氏功能评分（Karnofsky，KPS）≥70 分。排除标准：①肝肾等重要脏器严重功能障碍者；②合并其他恶性肿瘤病史；所有患者及家属均已签署知情同意书；本研究上报院伦理委员会并获得批准。③神经病变、认知障碍者；④临床资料缺失者。3组研究对象在性别、年龄上比较差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 临床资料收集

所有患者入院后统计年龄、性别、疾病史、病理分期、淋巴结转移、浸润深度、EB 病毒相关抗体等临床资料。预后统计：所有患者随访3～6年，直至患者任何原因导致死亡或随访日期结束，观察患者预后生存情况，并计算中位生存时间（median survival time，MST）。

1.2.2 血清EGFL7、MTA1蛋白表达检测

所有研究对象均入院后收集5 mL 空腹静脉血，采用酶联免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）及北京普朗酶标仪测定血清EGFL7、MTA1蛋白表达，450 nm 波长测定吸光度值。试剂盒购自Abcam公司，严格依照试剂盒说明书执行各项操作。

1.2.3 微血管密度（MVD）、淋巴管密度（LVD）水平测定

取鼻咽部组织行免疫组化染色测定MVD及LVD，于200倍显微镜下随机选取5个视野进行计数血管数和淋巴管数，取平均值作为MVD、LVD的最终结果。

1.3 统计学分析

采用SPSS 19.0软件进行数据分析，计数资料用n表示，行χ2检验。计量资料以（）表示，两两比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析；Spearman 检验分析血清EGFL7、MTA1蛋白与MVD、LVD 相关性；Kaplan-meier 生存函数分析EGFL7、MTA1 与患者预后的关系。P<0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 3组EGFL7、MTA1、MVD、LVD 水平比较

3组血清EGFL7、MTA1、MVD、LVD 比较：对照组＜未转移组＜转移组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

2.2 血清EGFL7、MTA1表达与鼻咽癌患者临床特征的关系

不同性别、年龄、EB 病毒相关抗体阴阳性血清EGFL7、MTA1蛋白水平比较差异无统计学意义（P>0.05）；不同TNM 肿瘤分期、有无淋巴结转移、浸润深度、分化程度患者血清EGFL7、MTA1蛋白水平比较差异具有统计学意义（P<0.05）。见表2。

表1 各组EGFL7、MTA1、MVD、LVD 水平比较（±s）Table1 Comparison of EGFL7，MTA1，MVD，and LVD levels in each group（±s）

表1 各组EGFL7、MTA1、MVD、LVD 水平比较（±s）Table1 Comparison of EGFL7，MTA1，MVD，and LVD levels in each group（±s）

注：与对照组比较，aP＜0.05；与未转移组比较，bP＜0.05。

组别对照组未转移组转移组F值P值n 20 38 22 EGFL7（ng/mL）44.8±5.8 178.6±15.7a 273.2±25.1ab 61.379 0.000 MTA1（pg/mL）28.3±3.9 145.5±11.6a 213.5±19.3ab 60.758 0.000 MVD 17.5±5.8 59.2±8.7a 82.2±8.6ab 39.454 0.000 LVD 2.4±1.2 4.4±1.5a 12.8±3.7ab 12.448 0.000

表2 血清EGFL7、MTA1表达与鼻咽癌患者临床特征的关系[n（%），（±s）]Table2 Relationship between serum EGFL7 and MTA1 expression and clinical characteristics of patients with nasopharyngeal carcinoma[n（%），（±s）]

表2 血清EGFL7、MTA1表达与鼻咽癌患者临床特征的关系[n（%），（±s）]Table2 Relationship between serum EGFL7 and MTA1 expression and clinical characteristics of patients with nasopharyngeal carcinoma[n（%），（±s）]

注：t1、P1为EGFL7 统计学分析值，t2、P2为MTA1 统计学分析值。

临床特征性别年龄EB 病毒相关抗体TNM 分期淋巴结转移浸润深度分化程度男女＞45≤45阳性阴性Ⅰ～ⅡⅢ～Ⅳ无有T1～2 T3～4低中高n=60 37（61.67）23（38.33）45（75.00）15（25.00）36（60.00）24（40.00）22（36.67）38（63.33）38（63.33）22（36.67）26（43.33）34（56.67）11（18.33）49（81.67）EGFL7（ng/mL）235.6±18.8 237.9±15.3 235.9±17.5 238.2±16.2 239.6±19.7 236.4±16.6 144.5±15.4 270.3±19.1 178.6±15.7 273.2±25.1 185.7±16.6 272.2±19.9 120.6±14.1 282.3±20.3 MTA1（pg/mL）179.3±16.4 178.2±15.3 177.6±18.4 179.5±19.0 181.5±22.8 177.4±16.2 103.2±14.9 213.2±18.7 145.5±11.6 213.5±19.3 162.7±15.4 218.2±18.7 114.5±13.3 219.5±16.0 t1值0.493 0.449 0.655 26.308 15.962 17.899 25.017 P1值0.624 0.655 0.515 0.000 0.000 0.000 0.000 t2值0.259 0.344 0.761 23.570 15.029 12.275 20.215 P2值0.797 0.732 0.450 0.000 0.000 0.000 0.000

2.3 血清EGFL7、MTA1表达与MVD、LVD 的相关性

相关性分析结果显示，EGFL7及MTA 蛋白分别与MVD、LVD 存在显著正相关性，差异有统计学意义（P<0.05）。见表3。

表3 血清EGFL7、MTA1表达与MVD、LVD 的相关性Table3 Correlation of serum EGFL7 and MTA1 expression with MVD and LVD

2.4 血清EGFL7、MTA1表达与鼻咽癌患者预后的关系

以鼻咽癌患者血清EGFL7、MTA1 平均值为中位数，分为低EGFL7 组、高EGFL7 组及低MTA1 组、高MTA1 组，Kaplan-meier 生存函数结果显示，低EGFL7 组的MST 为高于高EGFL7 组的MST，差异具有统计学意义（P<0.05）。低MTA1 组MST 高于高MTA1 组的MST，差异具有统计学意义（P<0.05）。见图1。

3 讨论

鼻咽癌为上皮源性恶性肿瘤，主要为黏膜上皮鳞状上皮化生基础上形成的癌变，病变区域存在丰富的淋巴组织。肿瘤细胞早期汲取营养主要途径为被动扩散，随着肿瘤生长，血液运输营养物质占据主导地位[6]。因此，新生血管的形成是肿瘤细胞增殖、浸润及转移的必要条件。EGFL7 为新发现的一种分泌型蛋白，其主要包含两个进化中高度保守的表皮生长因子样结构域，研究证实[7]EGFL7 在胚胎血管发育中发挥重要作用。近年来研究表明[8-9]，EGFL7 可增强内皮细胞和成纤维细胞的运动迁移能力，其在成熟组织中表达极低，但在肿瘤等增殖性组织中存在高表达。本研究中，鼻咽癌患者血清EGFL7 水平明显升高，且在存在淋巴结转移的鼻咽癌患者中EGFL7 水平更高。提示，EGFL7 表达水平升高与鼻咽癌疾病进展及淋巴结转移存在密切关系。另有研究指出[10]，EGFL7 可通过活化FAK 信号通路促进肿瘤细胞的侵袭和转移，抑制EGFL7 可降低肿瘤细胞的迁移运动。

MTA1基因为肿瘤转移有关基因家族的一员，在正常组织中MTA1表达水平极低，但在多种癌组织中呈高表达，并与恶性肿瘤的组织浸润、侵袭转移关系密切[11]。本研究结果提示，MTA1 在鼻咽癌细胞侵袭、转移过程中具有关键作用。本研究结果显示，不同TNM 肿瘤分期、有无淋巴结转移、浸润深度、分化程度患者血清EGFL7、MTA1蛋白水平血清EGFL7、MTA1 存在显著差异，且随着肿瘤进展，血清EGFL7、MTA1蛋白水平随之升高。本研究中，血清EGFL7、MTA1 与患者MVD、LVD 存在正相关性。提示，血清EGFL7、MTA1对鼻咽癌患者血管、淋巴结具有双重作用。侵袭转移是恶性肿瘤细胞的主要生物学特征之一，也是影响患者预后的主要影响因素。肿瘤内皮细胞分泌的EGFL7 蛋白从原发灶渗入血流，导致血清EGFL7 水平升高，EGFL7 蛋白从血液中捕获肿瘤细胞并促进其侵袭新的组织器官，从而导致转移性病灶的形成。同时，EGFL7 蛋白本身可刺激肿瘤细胞的运动迁移能力，参与了肿瘤原发灶向周围正常组织的侵袭转移[12-13]。MTA1蛋白含有1个锌指DNA 结合域及许多SPXX 域，这些结构参与了细胞生长、分化的信号传导途径的调控，因此MTA1蛋白水平升高促进了肿瘤的分化，促进其恶性程度增加和侵袭转移[14-15]。

综上所述，血清EGFL7、MTA1表达水平与鼻咽癌患者临床分期及淋巴结转移存在密切关系，血清EGFL7、MTA1 高表达鼻咽癌患者预后较差。