汪安石 刘畅 王继成 黄演林 张彦 丁红珂 刘玲 杨杰 吴菁 尹爱华★

Prader-Willi 综合征（Prader-Willi syndrome，PWS，OMIM 176270）及Angelman 综合征（Angelman syndrome，AS，OMIM 105830）是一对由基因组印记异常所致的疾病。Prader-Willi 综合征为父源染色体15q11.2-q13 区域印记基因的功能缺陷所致，Angelman 综合征是由母源染色体15q11.2-13上编码泛素蛋白连接酶E3 的UBE3A基因缺失或表达异常所致。二者共同的分子病理基础包括：染色体15q11.2-q13 片段缺失、单亲二倍体（uniparentaldisomy，UPD）、印记中心（imprinting centre，IC）缺陷及突变等[1-4]。PWS 与AS 在国外不同人群中报道的发病率间于1/15 000～1/25 000[1]，我国尚缺乏系统的流行病学研究数据[2]。

PWS和AS 的遗传学分析方案的制定取决于多因素，包括医保政策、转诊模式、实验室配置、实验技术的检测效力与检测成本等。目前诊断PWS和AS 最敏感的单一方法是使用分子遗传学技术分析15q11-q13 区域内的甲基化模式，通过分析母源性/父源性甲基化印迹来检测缺失、UPD和印迹缺陷。本研究设计了一套适合广东地区实际情况的PWS及AS 的遗传学分析方案，并将其应用于广东地区的临床实践。

1 材料与方法

1.1 一般资料

回顾性分析2013年7月至2017年12月经广东省妇幼保健院医学遗传中心确诊的39例Prader-Willi 综合征患儿及15例Angel man 综合征患儿的临床表现及遗传学特征。39例PWS 患儿中男24例、女15例（男女比例1.6∶1），确诊年龄间于8 天至6岁，新生儿期（≤28 d）确诊26例（平均年龄5.75天、标准偏差6.72）、婴儿期（29 d至1岁）确诊10例、幼儿期（1岁至3岁）确诊1例、学龄（前）期至青春期（＞3岁）确诊患儿2例。39例PWS 患儿主要临床表现为婴幼儿期肌张力低下、哭声微弱、反应差、喂养困难、性腺发育不良及皮肤色素减退、婴儿期后精神运动发育迟缓、认知行为异常、食欲旺盛、肥胖症、身材矮小（各年龄段的临床表现如表1 所示）。15例AS 患儿中男10例、女5例（男女比例2∶1），确诊年龄间于9 d至4岁，新生儿期确诊5例（平均年龄16.1 d、标准偏差9.08）、婴儿期4例、幼儿期5例、＞3岁患儿1例。15例AS 患儿主要临床表现为新生儿期喂养困难、婴儿期后出现明显发育延迟、运动或平衡障碍、爆发性大笑、肌张力低下、异常特征性EEG（各年龄段的临床表现如表2 所示）。收集患儿临床资料，包括母孕期情况、患儿体貌特征、肌力和肌张力、神经系统发育情况、性腺发育情况、平衡能力、特征性行为、语言发育情况、辅助检查结果等。该研究经广东省妇幼保健院伦理委员会审核通过。病例采集获受检者父母知情同意。

1.2 遗传学分析策略

本研究根据国家医保政策、广东省遗传代谢性疾病基本情况、本单位妇幼谢性疾病实验室配置等，综合考虑各项实验技术的检测效力与检测成本，设计了一套适合广东地区实际情况的PWS及AS 的遗传学分析方案（图1）。

表1 Prader-Willi 综合征患儿各阶段临床表现[n（%）]Table1 Clinical manifestations in children at different ages with Prader-Willi syndrome[n（%）]

表2 Angelman 综合征患儿各阶段临床表现[n（%）]Table2 Clinical manifestations in children at different ages with Angelman syndrome[n（%）]

1.3 甲基化特异性PCR

将基因组DNA 用CpGenome Turbo Bisulfite Modification Kit（Millipore，CA，USA）进行亚硫酸盐修饰，以正常人为阴性对照、明确诊断患者为阳性对照、未修饰基因组DNA 为系统对照，应用M（母源）、P（父源）两对引物同时对修饰后产物进行PCR扩增，扩增产物以琼脂糖凝胶电泳分离。引物序列及PCR反应条件参见文献[5]。检测结果呈如下几种情况：正常对照同时显示M（174 bp）、P（100 bp）两条带；PWS 阳性对照均仅显示M 带；AS 阳性对照均仅显示P 带；未经修饰的系统对照不显示任何条带。

1.4 微卫星STR 连锁分析

根据UCSC Genome Bioinformatics 提供的遗传信息及常见的断裂热点，选择了15q11-13 关键区 内 的7个 位 点D15S11、D15S646、D15S817、D15S128、D15S1513、GABRB3、D15S822及2个区外位点D15S659、FES，用于患儿核心家系的STR连锁分析，以明确患儿的分子缺陷类型。引物序列及PCR反应条件参见文献[6]。

1.5 UBE3A基因序列分析

对于疑似AS 而甲基化特异性PCR 检测阴性的病例，进行UBE3A编码区及临近内含子区序列分析。引物序列及PCR反应条件参见文献[7]。

1.6 染色体微阵列分析

对于需要进一步明确染色体断裂位点的病例或具有类PWS/类AS 临床表现而上述检测未能诊断的病例，通过染色体微阵列技术进一步分析。检测数据与OMIM、DECIPHER、DGV及PubMed等数据库信息比对。

2 结果

2.1 甲基化特异性PCR

39例患儿的检测结果仅显示M 带，提示为PWS；15例仅显示P 带，提示为AS。

2.2 微卫星STR 连锁分析

32例患儿在15q11-13 区域内只有母源染色体来源片段，缺乏父源染色体来源片段，而在15q11-13 区域外均有父母双方来源的染色体片段，提示分子病理类型为缺失型PWS。7例患儿有双拷贝母源染色体来源片段，缺乏父源染色体来源片段，提示为母源单亲二倍体所致PWS。14例患儿在15q11-13 区域内只有父源染色体来源片段，缺乏母源染色体来源片段，而在15q11-13 区域外均有父母双方来源的染色体片段，提示分子病理类型为缺失型AS。1例患儿有双拷贝父源染色体来源片段，缺乏母源染色体来源片段，提示为父源单亲二倍体所致AS（表3）。

表3 Prader-Willi 综合征及Angelman 综合征患儿的分子病理类型[n（%）]Table3 The pattern of underlying genetic mechanisms in our cohort[n（%）]

2.3 UBE3A基因序列分析

4例临床高度怀疑AS 而甲基化特异性PCR检测为阴性的病例行UBE3A编码区及临近内含子区序列分析，未检出UBE3A基因突变型AS。

2.4 染色体微阵列分析

21个PWS/AS 病例行染色体微阵列分析，并进一步明确染色体断裂位点与缺失区域。59例具类PWS/类AS 临床表现而上述检测未能诊断的病例行染色体微阵列分析，检出4例与PWS/AS 具有一定程度表型重叠的染色体微缺失/微重复综合征，分别是1p36 微缺失综合征1例、22q13.3 微缺失综合征1例、Mowat-Wilson 综合征1例以及Miller-Dieker 综合征1例。

3 讨论

本研究根据广东地区遗传代谢性疾病诊断的具体情况，设计了一套遗传分析策略。以甲基化特异性PCR 作为首选筛查方法[6，8-9]。用基于多重荧光标记PCR 的STR 连锁分析法对阳性病例进行分子致病机制探究[6-8，10]。对于临床高度怀疑AS而甲基化特异性PCR 检测阴性的病例，进行UBE3A编码区及临近内含子区序列分析[8]。而对于具有类PWS/类AS 临床表现而上述检测未能诊断的病例，进行染色体微阵列分析可能发现具有表型重叠的其它染色体微缺失/微重复综合征[11]。本方案在PWS/AS 的甲基化研究中选择了甲基化特异性PCR 法，而非可通过半定量方式同时检测15q11q13 内拷贝数变化及DNA 甲基化状态的MSMLPA 法，主要出于检测成本考量。甲基化特异性PCR 检测敏感性高、成本低，较适合本地区临床实践。此外，本研究选择基于多重荧光标记PCR的STR 连锁分析法而非SNP-array 法进行致病机制研究，主要从检测成本、检测时间、检测效力等角度考虑。基于多重荧光标记PCR 的STR 连锁分析法是一种经济、快捷的分析方法，检测成本约为30 元/核心家系，检测分析时间约为5小时，且检测结果直观、易于判读。SNP-array 法检测成本较高，检测时间较长，且仅能检出缺失型及同源性单亲二倍体型，而对于异源性及混合源性单亲二倍体型则需补充双亲SNP-array 检测结果一同分析，更增加了检测成本。

将这一PWS/AS 遗传学分析方案应用于广东地区的临床诊疗实践，共诊断PWS 患儿36例、AS 患儿14例。PWS及AS 呈现随年龄而异的时序化临床症候群、早期临床表现与多种神经系疾病存在重叠性，因而早期临床诊断存在一定困难。以往的研究中[6，12-14]，PWS 患者确诊的年龄中位数间于0.8至19.8岁，AS 患者确诊的年龄中位数间于0.9至6.2岁，延误了最佳诊疗时机，对患者的预后及生存质量造成不良影响。本研究在广东地区的临床实践中，将PWS及AS 患者的确诊年龄中位数降至18 d及27 d。系统分析PWS及AS 的临床和遗传学特征，于早期明确疾病诊断并确定分子缺陷类型[15-16]，及早开展干预治疗，有助于改善患儿预后[17-18]。