杨章武，张 哲，陈思源，葛 辉，陆承宽，林嘉铭，杜秀萍，郑雅友，李正良，林克冰，游伟伟

(1.福建省水产研究所，福建 厦门 361013；2.厦门大学海洋与地球学院，福建 厦门 361102；3.集美大学水产学院，福建 厦门 361021)

凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)原产于中南美洲太平洋沿岸水域，是目前我国对虾养殖产量最大的对虾种类。闽南地区是我国重要的凡纳滨对虾苗种生产基地。凡纳滨对虾适温范围13～40℃[1]，因其属热带性种类，而对低温的耐受性较差[2]，并且由于种源限制以及水域生态环境退化等原因，我国凡纳滨对虾养殖持续出现抗逆性退化、养殖存活率下降等现象。在大规模育苗生产中，探索有效、可行的凡纳滨对虾人工选育方法，提高凡纳滨对虾耐低温能力，对闽南地区虾苗业可持续发展具有重要意义。

对虾是变温动物，温度的变化可直接影响它们的生长、繁殖、发育、代谢、摄食甚至存活[3]。对虾耐低温性状属于数量性状(Quantitative traits)，易受生活环境的影响，通过统计学方法分析数量性状表型值，可以探究数量性状的遗传规律[4]。不同遗传背景的凡纳滨对虾人工选育群体杂交，其杂交子代仔虾幼体耐低温能力显著提高[5]。温度胁迫可影响凡纳滨对虾肝胰腺组织的抗氧化酶和消化酶活性及生长代谢和能量代谢等[6-7]。有关温度对凡纳滨对虾生理机能、免疫指标的影响研究，已有较多报道[8-12]。本文比较研究了人工选育凡纳滨对虾群体的自交和正、反杂交子代仔虾幼体的耐低温能力的实验，旨在探索人工筛选凡纳滨对虾具有耐低温性状子代的技术方法。

1 材料与方法

2018年5月31日在厦门市厦兴龙公司晋江种虾基地，用发育期为P11～P12的凡纳滨对虾仔虾幼体进行耐低温实验。

1.1 材料

实验虾苗是本项目组自行选育留种的4个凡纳滨对虾种虾繁育群体A、B、C、D，通过自交和正、反杂交繁育子代虾苗共16组，同时随机采购1组“土苗”(种虾来自一般食用虾养殖池的普通苗)。

1.1.1 种虾群体

A群体：引进自海南种虾的自交2代；B群体：引进自泰国种虾自交2代；C群体：引进自普瑞莫种虾的自交2代；D群体：由两个家系子代混合形成的群体，经自交传代6代。

1.1.2 实验虾苗

1.1.1中4个选育群体种虾自交和正、反杂交，形成16组虾苗。按凡纳滨对虾常规育苗方法，培育至P11～P12。17号是随机采购自厦门市海沧鳌冠村育苗场的发育期相同的“土苗”。表1是17组实验虾苗的种质来源情况及实验时的体长。

表1 凡纳滨对虾仔虾幼体耐低温实验各实验号种源与体长信息

1.2 实验方法

1.2.1 设施

将挖好圆孔的塑料泡沫板漂浮在容积500 L的玻璃钢圆桶水面，桶面直径95 cm，用循环式冷水机制冷降温。在不锈钢漏杯内放置实验虾苗。漏杯直径8 cm、高10 cm，吃水约450 mL，套在泡沫板圆孔里确保其浮于实验桶水面。

1.2.2 方法

玻璃钢桶装满海水，冷水机制冷，使水温达到初始实验水温18℃。17组虾苗，每组设3个平行，共51个漏杯，分为2个实验桶同时进行。

虾苗从水温28～30℃的育苗池取出，在自然水温条件下计数并放入漏杯，每杯放苗50尾。在计数过程中，用泡沫箱装上育苗池的水放入漏杯，计数后同时放入实验桶。计数时要选择健康、无异常虾苗。

根据预实验观察到，虾苗在12℃左右大量死亡，而且48 h时存活很少。据此，低温实验设定实验最低温度为14℃。低温实验从18℃开始，每小时记录水温1次。实验开始后的6、12、24、36和48 h分别统计各杯死亡数量和存活数量。实验桶不间断充气，每个杯用吸管投放卤虫无节幼体。低温实验的盐度为28。

1)计数方法：用1个透明小塑料盆装少量实验桶的水(水温或盐度保持一致)，实验杯移出放在小盆内，用手电照射，用镊子或吸管计数。

2)实验虾苗体长测量：每组取虾苗20尾，将其低温冻死后置于方格纸上拍照。照片在Photoshop系统中以像素比例进行长度测量。为便于照片上辨认，以眼睛到尾扇末端的长度作为体长数据。

3)数据分析：使用SPSS 22对不同组别存活率进行差异显著性分析和多重比较。为综合评价整个实验过程的耐低温能力，以存活率排名赋值法对不同时段的存活率进行赋值排名，以总排名评价各组耐低温能力。具体方法：同一时段各组存活率从大到小排名，第一名赋值1、第二名赋值2，以此类推，然后取各组在不同时段的排名均值作为该组的存活率总排名。考虑到仔虾幼体个体大小与耐低温能力成正相关，即规格越大，耐低温能力越强[5]。在本文分析比较由不同组种质体现的耐低温能力时，应扣除因虾苗规格大而增加的存活率部分，因此，在相同存活率情况下，体长越小说明其由种质决定的耐低温能力越强。从而，体长大小反映在(种质)耐低温能力对应的存活率排名上就是从小到大进行排名，即体长最小的排名第一名，赋值为1。

4)耐低温存活率杂交优势率估算：以杂交组双亲各自自交子代的存活率平均值作为该杂交组的双亲均值。杂交组存活率与双亲均值之差，与双亲均值之比为该杂交组的杂交优势率。

2 实验结果

实验虾苗从正常水温28～30℃瞬间、同时进入18℃实验水温。实验水温13.5～19.0℃，水温变化见图1。

2.1 不同种源仔虾幼体低温存活率差异分析

表2是不同亲本组合各组仔虾幼体低温实验不同时长的累计平均存活率。在低温6 h时水温降至15.0℃(图1)，各组存活率多数接近或大于95%，差异不明显。随着实验水温下降和实验时间延长，各组存活率快速下降，并逐渐显示组间差异。

在低温实验12 h时水温降至14.5℃，表2显示各组存活率差异逐渐明显，存活率最低有9号、12号两组已降至约50%。从12 h到24 h期间，水温曾回升到19.0℃然后又回落到14.0℃，存活率快速下降，不同组差异更明显，10号已全部死亡，其中3组(4、12、15号)存活率只有个位数，而土苗组存活率还有近80%。从24 h到36 h期间，水温先升到16.0℃，后降至13.5℃，全部死亡增加到2组(7、10号)，11号和17号存活率最高，分别为33.7%和43.7%。在48 h时全部死亡增加到5组(4、7、9、10、16号)。第17号土苗存活率最高，为30.4%，而且在实验过程中任何时间都显著高于其他组，48 h的最后存活率是其他实验组的两倍以上。土苗耐低温的能力强于所有选育组。

表2 不同低温时长凡纳滨对虾仔虾幼体各组累计存活率

用SPSS 22对各组存活率进行线性单变量分析。S-N-K多重比较，对同一实验时间各组归类为若干子集，而同一子集则无显著差异。分析结果显示，在低温6 h时17个实验号存活率在同一子集，存活率无显著差异(P>0.05)；在低温12 h时存活率最高的子集包含了11组，存活率为77.7%～97.5%。表3是低温24、36和48 h时相应最高存活率子集所包含的实验号。表3显示，17号土苗存活率最高，三种实验时长都是单独子集，与其他组差异显著(P<0.05)。低温24 h时，6号、2号在次低子集，与除1号和11号外的其他组差异显著(P<0.05)。在低温36 h时，11号也自成一个子集，在选育组中存活率最高，与其他组差异显著(P<0.05)，而第1、第2和第6号是次高子集中存活率最高的3个组，但与其他12组存活率无显著差异(P>0.05)。在低温48 h时，第6号和第11号两组属于存活率仅次于17号的次高子集，与其他组差异显著(P<0.05)。1号、2号同属次高子集，但与其他12组存活率无显著差异(P>0.05)。

表3 不同低温时长最高存活率子集

注：右上角标注“##”或“#”的组号或存活率数据，表示其与同行各组为不同子集，存活率差异显著(P<0.05)。无标注的属相同子集。

Notes：The group number or survival rate data marked with“##”or“#”in the upper right corner indicated that they were different subsets from each other.The difference of survival rate was significant(P<0.05).Identical subsets without mark.

分析表3的结果表明，在24、36、48 h时最高存活率子集中(17号除外)，最高的3组(2、6、11号)都是相同的，且36和48 h存活率高低排序(11>6>2)完全一致。不同实验时长的最高存活率子集都包含或仅有11、6和2号，表明在16个选育组中该3组存活率最高，耐低温能力最强，且在24和48 h时与其他选育组差异显著(P<0.05)。

2.2 不同种源仔虾低温存活率排名赋值分析

凡纳滨对虾仔虾不同组别在48 h低温实验期间，不同时间段死亡率有所不同，死亡时间有早有晚。为综合评价实验过程的整体耐低温能力，从各组出现明显差异的24 h开始，以不同时段存活率排名赋值进行分析比较。低温实验各组存活率排名赋值，存活率从大到小，体长从小到大，分别给予从1到17的赋值。赋值情况见表4。

表4 凡纳滨对虾仔虾幼体低温实验存活率、体长排名赋值表

续表4

表4显示，综合各实验时长存活表现和体长因素，16个交配组合中(17号土苗除外)存活率排名均值前3位分别是11号(C♀×A♂)、2号(B♀×A♂)和6号(A♀×A♂)，排名与SPSS多重分析结果重合。存活率最低、排名最后的3组，分别是10号(B♀×D♂)、7号(D♀×D♂)和8号(C♀×C♂)，该3组低温48 h时平均存活率为0。

分析表4还显示，存活率最高的3组均是A群种虾的自交和杂交子代，与D群种虾无关。而存活率最低的3组，除8号外其他3组均是D群种虾的自交和杂交子代，4组都与A群种虾无关。表明不同种源其子代仔虾耐低温能力有显著差异。

2.3 虾苗耐低温能力与杂交优势的相关性

表5是根据低温实验48 h时各组存活率，估算各组耐低温存活率的杂交优势。表5显示，存活率最高的杂交组11号和2号，48 h存活率杂交优势率分别是68.2%和11.7%。而耐低温能力最差、排名最后的3个杂交组( 10、9和15号)的48 h存活率杂交优势率分别为-100%、-100%、-77.5%。不同种源仔虾幼体耐低温能力的杂交优势率有显著差异。

表5 低温实验48 h存活率的杂交优势估算

注：存活率是低温48 h时的存活率，优势率是48 h存活率的杂交优势率。

Notes：The survival rate was the survival rate at 48 hours of low temperature，and the odds ratio was the heterosis rate at 48 hours of survival rate.

3 讨论

1)从低温实验过程存活率变化来看，各组存活率在实验6 h时差异不明显，12 h开始有明显差异。36 h多数存活率已经很低，只有个位数。而48 h已经有将近1/3的实验组存活率为0。因此，48 h 的观察时长足以显示不同组别的耐低温能力。

用排名赋值对多个指标的实验数据进行综合排名和评价，从感性上具有一定的合理性。排名赋值方法简单、结果明晰，作为本文数据分析的辅助方法，其分析结论与常规分析方法结果相同，有相互印证的作用。但由于排名赋值是整数，相邻两个排名的排名赋值可能无法真正反映其存活率的实际差值，这会给最终排名带来一定的误差。

2)已有研究表明[13-15]，凡纳滨对虾、中国对虾耐低温性状遗传力为低等遗传力。但本实验结果表明，不同种质来源的群体，虾苗耐低温能力确有显著差异，而且这种差异与特定亲本群体相关。在水产动物杂交育种中，通过自交系间的杂交，可以获得显著的杂种优势[16]。杂交优势估算结果表明，不同亲本群体，其子代虾苗耐低温存活率的杂交优势率显著不同。这说明虽然凡纳滨对虾耐低温性状代际遗传可能不稳定，但耐低温性状可以是特定种质群体在特定发育阶段和栖息环境下的固有性状。

进一步的养殖对比实验(另文报道)还表明，耐低温能力最强的3组(2、6、11号)，养成期生长速度在17个实验号中分别排名第2、5和6名，生长速度排名比较靠前。而耐低温能力最弱的5组(4、7、9、10、16号)，养成期生长速度在17个实验号中分别排名第11、17、13、12名，生长速度排名显著靠后。显示仔虾期耐低温能力强的组合养成期生长快，耐低温能力弱的组合养成期生长慢。这种现象是否具有普遍性还有待进一步观察，但可为性状选择提供参考。

3)“土苗”系指亲本来源于一般商业化对虾养殖池，种质背景不够清晰的普通凡纳滨对虾苗。因其生长性状较差，不纳入选育对象，只作为选育群体的对照组。从本实验结果看，土苗生长性状很差，16个选育组除7号(D♀×D♂)体重生长速度低于土苗外，其他选育组养成期生长速度是土苗的1.18～2.10倍(另文分析)，但土苗耐低温能力特别强，同时耐低盐能力又特别弱(另文分析)。与4个基础群体(A、B、C、D)子代比较，土苗是随机采购自虾苗市场的，没有对耐低温、低盐性状的定向选育，却有着最强的耐低温能力和最弱的耐低盐能力，这为凡纳滨对虾选择育种研究提出了需要进一步探索的问题。