陈卫刚，包莹莹，何玉琴，*，葛闻博，张 霞，华道才让，杨大鹏，周凯仁

(1.甘肃农业大学 生命科学技术学院， 甘肃 兰州 730070； 2.甘肃省甘南藏族自治州夏河县甘加乡畜牧兽医工作站，甘肃 夏河 747199)

哺乳动物的生殖活动以下丘脑-垂体-性腺轴(hypothalamic-pituitary-gonadal axis，HPGA)为主导，相互协调有规律地进行着复杂的繁殖生理活动过程[1-2]。近年来的研究发现，哺乳动物KISS-1基因能调节下丘脑促性腺激素释放激素(gonadotropin-releasing hormone，GnRH)的释放，进而促进促卵泡素(FSH)和促黄体素(LH)的分泌[3-4]，影响初情期启动、季节性繁殖、发情周期、排卵、妊娠和泌乳等生殖活动[5-13]。GPR54作为Kisspeptin的特异性受体，在KISS-1/GPR54系统对动物生殖生理调控中起到不可或缺的作用。Funes等[14]运用基因打靶手段敲除雌性和雄性小鼠的GPR54基因，发现雄性小鼠表现为睾丸和输精管发育不完全，雌性小鼠基本丧失生育功能。对遗传背景相同的小鼠进行KISS-1和GPR54基因敲除，结果发现，KISS-1敲除小鼠表型的严重程度要低于GPR54敲除小鼠表型，但都具有一定程度的变异性。大量研究结果都揭示了Kisspeptin必须与GPR54结合后才能发挥其生物学作用[15]。但KISS-1/GPR54对动物生殖活动过程调控功能和机理研究相对较少，其对动物发情周期各阶段的调控机理研究鲜有报道。高原甘加藏羊是季节性发情动物，生活在海拔3 000 m以上的高寒牧区，具有抗高寒、抗逆性、遗传性稳定等种质特性，因此研究其生殖生理特性对藏区畜牧业发展具有重要意义。目前有关KISS-1/GPR54对高原甘加藏羊发情周期等生殖活动的影响及其调控机理研究未见报道。本研究首次对甘加藏羊发情周期各时期HPO中KISS-1/GPR54表达和分布变化进行了研究，以揭示KISS-1/GPR54对藏羊季节性发情及发情周期等繁殖生理活动的调控作用。

1 材料与方法

1.1 样品采集

在藏羊的繁殖季节(7—9月)，于甘肃甘南甘加乡羊场选择年龄2.5～3.5岁健康且空怀的雌性甘加藏羊32只，按照发情周期的4个时期分为4组，每组8只，采取自由放牧，跟踪观察2个发情周期后开始取样。根据公羊试情结合母羊阴道涂片法鉴定其发情状况，分别在发情前期、发情期、发情后期、间情期，将其颈部局部麻醉后进行颈动脉放血无痛处死(符合国家有关动物伦理动物福利方面的相关规定)，迅速打开颅腔和腹腔，完整取出下丘脑、垂体及卵巢轴组织，各组织均等分为2份，分别置于液氮和4%多聚甲醛固定液保存，液氮中组织速冻后移至-80 ℃冰箱冻存备用。

1.2 总RNA提取与实时荧光定量PCR

严格按照TRIzol试剂(Invitrogen，美国)总RNA提取试剂盒说明书，提取各组织总RNA。提取到的RNA经超微量核酸蛋白测定仪检测浓度和纯度。用1%琼脂糖凝胶电泳检测所得RNA完整性，可清晰看到28S、18S和5S条带。反转录严格按照购买的cDNA反转录合成试剂盒(全式金，北京)说明进行操作。

利用NCBI查找绵羊的KISS-1、GPR54和β-actin基因序列，运用Premier 5.0软件设计引物(表1)，由上海生工生物科技有限公司合成。

以反转录得到的cDNA为模板，进行qRT-PCR检测分析。总反应体系为20 μL：模板1 μL，上、下游引物各0.5 μL，2×TransStart TiP Green qPCR SuPerMix 10 μL，ddH2O 8 μL。反应条件为：94 ℃预变性30 s；94 ℃ 5 s，60 ℃退火30 s，循环次数45次，每个样品设置3个重复。

1.3 数据分析

所得相关数据用2-ΔΔCt方法计算，每个基因表达量均以β-actin内参基因进行校正。所有数据用SPSS17.0软件进行方差和显著性分析，结果用平均值±标准差表示。

1.4 下丘脑-垂体-卵巢轴组织Kisspeptin、GPR54分布的免疫组织化学染色分析

石蜡切片脱蜡处理后，利用H2O2孵育10 min，封闭内源性过氧化物酶，后利用过氧化物标记的链霉卵白素(streptavidin/peroxidase，SP)法进行染色。Kisspeptin和GPR54抗体(博奥森， 北京)以1∶400稀释，阴性对照用磷酸缓冲盐溶液(PBS)代替一抗，4 ℃孵育过夜，然后与二抗(博奥森，北京)室温反应10 min后用二氨基联苯胺(DAB)(博奥森，北京)显色，脱水透明后用中性树胶封片。利用BX51-DP71(麦克奥迪，日本)正置光学显微镜观察并拍照。Kisspeptins和GPR54阳性部位呈现棕色，其光密度值与Kisspeptins和GPR54的表达成正比。利用Imge ro Plus 6.0(IPP)图像分析软件处理数据，结果用平均值±标准差表示，利用统计软件SPSS 17.0对数据进行方差分析。

表1KISS-1、GPR54和β-actin基因引物序列

Table 1 Primer sequences ofKISS-1，GPR54 andβ-actin

基因Gene引物序列Primer sequences (5′→3′)产物长度Product length/bpKISS-1GCCTTCAGGGAGACCTTGGAGAGCTCTCAGAGGAGCAGAG179GPR54β-actinACGGACTTAATGTTCCTGCTGTGACCGAGACCTGCTGGATGTAGTTCCTCCAGCCTTCCTTCCTGGGGCTTTAGTTTCGGTTTGTTGT119180

P

2 结果与分析

2.1 甘加藏羊发情周期下丘脑-垂体-卵巢轴组织中的KISS-1、GPR54基因表达

甘加藏羊发情周期下丘脑-垂体-卵巢轴组织中均有KISS-1和GPR54基因的表达。下丘脑中KISS-1的表达量在发情前期达到峰值，显著(P<0.05)高于其他发情时期；GPR54的表达量在发情期显著(P<0.05)高于发情前期、发情后期和间情期(图1-A)。垂体中，发情前期KISS-1的表达量最高，发情后期显著(P<0.05)低于其他各时期；GPR54的表达量在发情前期达到最高，显著(P<0.05)高于其他各发情时期，发情后期表达量最低(图1-B)。卵巢轴组织中KISS-1在间情期的表达量显著(P<0.05)高于其他时期；GPR54在发情后期显著(P<0.05)高于其他发情时期(图1-C)。

A，下丘脑；B，垂体；C，卵巢轴。E，发情期；ME，发情后期；DE，间情期；PE，发情前期。不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下同。A， Hypothalamic; B， Pituitary; C， Ovary axis. E， Estrus; ME， Metaestrus; DE， Diestrus: PE， Proestrus. The bars with different lowercase letters indicated significant difference (P<0.05). The same as below.图1 甘加藏羊发情周期各时期KISS-1、GPR54在HPOA中的相对表达量Fig.1 Relative expression of KISS-1 and GPR54 in HPO at different stages of estrus cycle in Ganjia Tibetan sheep

2.2 下丘脑-垂体-卵巢轴组织Kisspeptin和GPR54免疫组织化学染色

甘加藏羊发情周期各时期下丘脑、垂体和卵巢轴中均有Kisspeptin(图2)和GPR54(图3)蛋白表达，且阳性着色强弱差异明显。下丘脑中，Kisspeptin阳性着色主要在锥体细胞和神经细胞的胞质和颗粒细胞的胞核中(图2-A～D)，在发情前期呈强阳性表达呈深棕色(图2-D)，表达量高于其他时期(图4-A)，GPR54主要在下丘脑神经细胞的胞质和轴突上表达(图3-A～D)，发情期表达量明显高于其他时期；在腺垂体中，Kisspeptin(图2-E～H)和GPR54(图3-E～H)最主要表达在嗜碱性细胞的胞质中，嫌色细胞的胞质中也有少量表达，二者均在发情前期表达量高于其他时期(图4-B)；卵巢轴中的Kisspeptin(图2-L)和GPR54(图3-L)在发情前期主要表达于卵泡细胞，卵泡膜上有少量表达，发情期则主要在颗粒层和卵泡膜内层为高表达(图2-I、图3-I)，进入发情后期和间情期，主要在颗粒层、卵泡内膜和卵泡外膜上表达，尤其在卵泡外膜的表达量增加(图2-G、图3-G)，发情期Kisspeptin蛋白表达量高于其他时期，发情前期GPR54蛋白表达量高于其他时期(图4-C)。

3 讨论

本研究探讨了KISS-1和GPR54在甘加藏羊发情周期下丘脑-垂体-卵巢轴中的分布与表达。研究发现，KISS-1 mRNA表达量在下丘脑组织中发情前期最高，而王军等[16]在小尾寒羊下丘脑中发现其在发情期最高，与本实验研究结果有出入，这可能是物种及生活环境差异所致。曹婷等[17]对五指山猪的研究发现，Kisspeptin表达量的不同会直接影响初情期出现的时间。甘加藏羊发情前期KISS-1表达量达到最高，是为发情期出现做充足准备；GPR54的表达量在发情期到达峰值，而后逐渐降低，说明该系统主要在发情期调控甘加藏羊的生殖活动，这与王军等[16]对小尾寒羊的研究结果基本一致。Smith等[18]用Kisspeptin刺激离体培养的垂体细胞，能有效促进FSH和LH的释放，但是效果不及GnRH的作用明显。本实验结果显示，垂体中KISS-1、GPR54在发情前期表达量高于其他发情时期，结合前人研究结果推测Kisspeptin在甘加藏羊垂体中可能主要是通过旁分泌或者自分泌的形式对FSH和LH的分泌起重要调控作用，说明甘加藏羊垂体组织中KISS-1/GPR54系统主要在发情前期调控生殖活动。大量研究表明，Kisspeptin对卵巢中卵泡的形成和排卵过程具有十分重要的调控作用[19-20]。对大鼠[21]和绵羊[22]的研究发现，不同发情时期卵巢中KISS-1表达量不同，在排卵前显著上升。Gottsch等[23]研究发现，在下丘脑的ARC区，雌二醇(E2)通过非经典信号途径抑制Kisspeptin的表达，从而负反馈调控GnRH的释放。本研究发现卵巢轴组织中KISS-1的表达量在发情前期和发情期皆表现为低水平表达，而在间情期表达量最高，说明KISS-1的表达量在甘加藏羊发情期间受到催乳素和雌二醇等内分泌激素的负反馈调节作用，对卵泡发育过程所发挥直接调控作用较弱，而主要通过KISS-1/GPR54系统耦联下丘脑-垂体-卵巢轴来实现；此研究结果与吕甲强[24]在黑线雌性仓鼠卵巢中研究发现GPR54表达变化与KISS-1表达基本相近具有相似性，说明KISS-1/GPR54系统对甘加藏羊卵泡发育、成熟和排卵有着重要的调控作用，但同时也可能受到雌二醇等内分泌激素的负反馈调节作用，另外该系统可能还参与妊娠活动的调控作用，具体机制有待进一步研究。

NC，神经细胞；Nu，核仁；GC，颗粒细胞；PC，锥体细胞；AC，嗜酸性细胞；BC，嗜碱性细胞；CC，嫌色细胞；SC，窦状毛细血管；CF，胶原纤维；PO，初级卵母细胞；FA，卵泡腔；FC，卵泡细胞；ZP，透明带；SG，颗粒层；TF，卵泡膜；TFI，卵泡膜内层；TFE，卵泡膜外层；IC，间质细胞。下同。NC， Neurocyte; Nu， Nucleoli; GC， Granular cells; PC， Pyramidal cells; AC， Acidophilic cells; BC， Basophilic cells; CC， Chromophobe cells; SC， Sinusoidal capillaries; CF， Collagenous fibers; PO， Primary oocytes; FA， Follicular antrum; FC， Follicular cells; ZP， Zona pellucida; SG， Stratum granulosum; TF， Theca folliculi; TFI， Theca folliculi interna; TFE， Theca folliculi externa; IC， Interstitial cells. The same as below.图2 甘加藏羊发情周期Kisspeptin在HPOA组织中的分布和表达Fig.2 Distribution and expression of Kisspeptin in HPOA tissue during estrus cycle of Ganjia Tibetan sheep by immunohistochemical staining

图3 甘加藏羊发情周期GPR54在HPOA组织中的分布和表达Fig.3 Distribution and expression of GPR54 in HPOA tissue during estrus cycle of Ganjia Tibetan sheep by immunohistochemical staining

图4 甘加藏羊发情周期HPOA组织Kisspeptin、GPR54阳性染色产物的平均积分光密度值Fig.4 Average integral optical density (IOD) of Kisspeptin and GPR54 positive staining in HPOA tissues during estrus cycle of Ganjia Tibetan sheep

人的大脑组织中，Kisspeptin表达量最高在弓状核(ARC)和脑室前腹侧区(AVPV)[25]，而Gottsch等[23]在小鼠上发现除了在ARC和AVPV区外，在下丘脑室周核(PeN)也有Kisspeptin的表达。Navarrov等[26]研究发现，大鼠GPR54的表达主要在GnRH的神经核团上。本实验对甘加藏羊研究发现，其下丘脑中Kisspeptin和GPR54分别在发情前期和发情期为强阳性表达，阳性产物主要表达在神经细胞及锥体细胞的细胞质中，而在颗粒细胞的胞核中发现阳性反应。刘海斌等[27]利用免疫组织化学方法研究鸡脑中Kisspeptin和GPR54的表达发现，发情期腺垂体中有大量的Kisspeptin和GPR54分布，与本实验研究结果相似，主要在嗜碱性细胞的胞质中表达，在嫌色细胞胞质中也有表达。卵巢轴中研究结果发现，在发情前期，Kisspeptin和GPR54主要分布在卵泡细胞，卵泡膜细胞中呈弱阳性表达，发情期则主要在卵泡颗粒细胞及卵泡膜上表达，发情后期及间情期卵泡膜上的阳性表达减弱，主要在卵泡颗粒细胞及黄体细胞中表达，这一结果与Castellano等[21]对大鼠的研究结果一致。

综上，KISS-1/GPR54系统对甘加藏羊发情周期起到一定的调控作用，下丘脑中通过与GnRH神经元的直接接触，促使GnRH释放；垂体及卵巢轴中主要通过偶联下丘脑-垂体-卵巢轴间接刺激调节方式对甘加藏羊的生殖生理活动进行调控。研究发现，该系统对甘加藏羊发情周期及生殖活动的调节作用主要在发情前期及发情期期间，尤其对GnRH的释放及卵泡发育和成熟释放过程有重要的调节作用，具体机制还有待研究。