艾福录 吕武 赵国华

摘要 目的：探讨蓝莓花青素（BA）对人胃腺癌BGC-823细胞增殖、侵袭的影响及相关机制。方法：低、中、高剂量实验组与对照组人胃腺癌BGC-823细胞分别以25、50、100 μg/mL BA与等量生理盐水处理，分别处理12 h、24 h、48 h。采用噻唑蓝（MTT）与流式细胞仪检测人胃腺癌BGC-823细胞增殖与凋亡;采用Transwell小室实验与免疫细胞化学法检测人胃腺癌BGC-823细胞侵袭与P53、半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）蛋白表达。结果：干预48 h时，对照组、低、中、高剂量实验组人胃腺癌BGC-823细胞P53与Caspase-3蛋白阳性细胞百分比分别为（11.12±1.01）%，（24.31±2.18）%，（47.56±2.91）%，（66.49±5.14）%与（15.04±1.23）%，（28.22±3.09）%，（69.36±5.42）%，（86.52±6.15）%。实验组胃腺癌BGC-823细胞增殖抑制率随BA浓度增大而逐渐升高;与对照组比较，低、中、高剂量实验组人胃腺癌BGC-823细胞凋亡率、P53与Caspase-3蛋白阳性细胞百分比均显著升高，侵袭率降低，呈浓度依赖性（均P<0.05）。结论：BA可有效抑制胃腺癌BGC-823细胞增殖，诱导其凋亡，并降低侵袭能力，其机制可能与上调P53与Caspase-3蛋白表达有关。

关键词 胃腺癌;蓝莓花青素;增殖;侵袭;P53;半胱氨酸蛋白酶-3

Abstract Objective：To investigate the effects and related mechanism of blueberry anthocyanins （BA） on the proliferation and invasion of human gastric adenocarcinoma BGC-823 cells.Methods：Human gastric adenocarcinoma BGC-823 cells exp-L/M/H and the control group were treated with BA at the concentration of 25，50，100 μg/mL and the same amount of normal saline respectively，and each group was treated for 12，24，and 48 hours.The proliferation and apoptosis of human gastric adenocarcinoma BGC-823 cells was detected by MTT assay and Flow cytometry; Transwell chamber assay and immunocytochemistry method were used to detect the invasion of human gastric adenocarcinoma BGC-823 cells and the expression of P53 and caspase-3 protein.Results：At 48 h after intervention，the percentage of P53 cells and Caspase-3 protein positive cells in human gastric adenocarcinoma BGC-823 cells in the exp-L/M/H were （11.12±1.01）%，（24.31±2.18）%，（47.56±2.91）%，（66.49±5.14）% and （15.04±1.23）%，（28.22±3.09）%，（69.36±5.42）%，and （86.52±6.15）%，respectively.With the increase of BA concentration，the proliferation inhibition rate of gastric adenocarcinoma BGC-823 cells in experimental group increased gradually; Compared with the control group，the apoptotic rate，P53 protein and Caspase-3 protein positive percentage of human gastric adenocarcinoma BGC-823 cells in the exp-L/M/H groups significantly increased，while the invasive rate decreased and the trend was concentration-dependent （all P<0.05）.Conclusion：BA can effectively inhibit the proliferation of gastric adenocarcinoma BGC-823 cells，induce its apoptosis，and reduce its invasive ability，which may be related to the up-regulation of P53 protein and Caspase-3 protein expression.

Keywords Gastric adenocarcinoma; Blueberry anthocyanins; Proliferation; Invasion; P53; Cysteine protease-3

胃癌是較为常见的恶性肿瘤，具有高度异质性，侵袭和转移力极强[1]。已有研究证实，花青素可抑制肺癌、结肠癌及乳腺癌等多种肿瘤细胞增殖及侵袭[2]。研究发现，蓝莓花青素（BA）可通过线粒体凋亡途径对人胃腺癌BGC-823细胞具有生长抑制和诱导凋亡作用[3]。也有研究发现，BA可通过下调P53基因DNA甲基化抑制口腔癌KB细胞增殖及诱导凋亡[4]。目前，关于BA在胃腺癌细胞方面的相关研究报道较少，因此本研究旨在探讨BA对人胃腺癌BGC-823细胞增殖、侵袭能力及P53、半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）表达的影响，为临床治疗胃腺癌寻找高效、低毒的干预新手段。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞 人胃腺癌BGC-823细胞株，购自中国医学科学院药物研究所细胞库。用含10%胎牛血清、100 U/mL青链霉素的DMEM培养基培养人胃腺癌BGC-823细胞，置于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养并传代。

1.1.2 药物 蓝莓花青素（河南华驰生物科技有限公司，生产批号20190820），纯度90%。

1.1.3 试剂与仪器 噻唑蓝（MTT）（美国Sigma公司，生产批号：H17088）;胎牛血清、DMEM培养基（美国Gibco公司，生产批号：M170312）;Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司，生产批号：K180408）;Matrigel胶（美国BD公司，生产批号：M180409）;鼠抗人P53、Caspase-3多克隆抗体（美国Santa Cruz公司，生产批号：M180207）;免疫细胞化学试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司，生产批号：K180801）等。二氧化碳培养箱（德国Thermo scientific公司，型号：KSD-1211）;超净工作台（苏州长留净化科技有限公司，型号：SKS-1102）;Transwell小室（美国Millipore公司，型号：MSG-1277）;光学倒置显微镜（日本Olympus公司，型号：XSK1100）;C6 Flow Cytometer流式细胞仪（美国BD公司，型号：DKD-8700）等。

1.2 方法

1.2.1 人胃腺癌BGC-823细胞培养[5]、分组及处理 用含10%胎牛血清、100 U/mL青链霉素的DMEM培养基培养人胃腺癌BGC-823细胞，置于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养并传代。取对数期人胃腺癌BGC-823细胞，接种于96孔板中。低、中、高剂量实验组及对照组分别以25、50、100 μg/mL BA、等量生理盐水处理，各组分别干预12、24、48 h。

1.2.2 MTT法[6]检测人胃腺癌BGC-823细胞增殖情况 细胞分组及处理同1.2.1，分别于干预12、24、48 h后，每孔加MTT（5 mg/mL）溶液20 μL，孵育4 h。于570 nm处检测各孔光密度（OD）值，计算人胃腺癌BGC-823细胞增殖抑制率=（1-实验组OD570 nm/对照组OD570 nm）×100%。并设置8复孔对照，且各组均重复3次。

1.2.3 流式细胞仪[7]检测人胃腺癌BGC-823细胞凋亡率 人胃腺癌BGC-823细胞调整密度为5×104个/mL，接种于24孔板，细胞处理及分组同1.2.1，并设置6复孔，且各组均重复3次。分别于孵育12 h、24 h、48 h后，按试剂盒说明书收集细胞，洗涤，重悬于Binding buffer，加入AnnexinV/FITC（5 μL）和碘化丙錠（PI）染色液（10 μL），避光处反应10 min，采用流式细胞仪BD FACSuite软件作图，统计Q2与Q3区细胞凋亡数目，细胞凋亡率（%）=凋亡细胞数Q2+Q3/细胞总数Q2+Q3×100%。

1.2.4 Transwell小室实验[8]检测人胃腺癌BGC-823细胞侵袭能力 将人工基质胶50 μL分别涂于Transwell插入式的培养皿滤膜的24孔表面，孵育6 h，形成凝胶状物质。收集对数期、用无血清DMEM处理的人胃腺癌BGC-823细胞，细胞分组及处理同1.2.1;下室加含10%胎牛血清DMEM培养基，500 μL/室，48 h后，甲醛固定，0.5%结晶紫染色。将以上各小室内表面没有穿透滤膜的细胞均擦掉，于光学倒置显微镜下计数侵袭细胞数量。侵袭率=下室细胞数量/细胞总数量×100%。

1.2.5 免疫细胞化学法[9]检测人胃腺癌BGC-823细胞P53、Caspase-3蛋白表达 灭菌的盖玻片吸附于24孔板，取对数生长期胃腺癌BGC-823细胞，调整密度为1×105个/mL，接种于24孔板，细胞分组及处理同1.2.1，设正常和阴性对照组。24 h后取出盖玻片，PBS清洗，丙酮固定，过氧化酶阻断剂30 min，与一抗（P53、Caspase-3抗体，1∶500）和二抗（1∶500）结合，显色，苏木精复染，封片。每张玻片于光学显微镜下（×400）随机计数1 000个细胞，同时计数阳性细胞数，以胞质出现淡黄色至棕黄色为阳性。阳性率=阳性细胞数/细胞总数×100%。

1.3 统计学方法 采用SPSS 21.0统计软件对研究数据进行统计分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，符合正态分布时，2组之间比较采用Dunnett′s t检验;不符合正态分布时，采用秩和检验分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组不同时间点人胃腺癌BGC-823细胞增殖抑制情况 干预48 h时，低、中、高剂量实验组胃腺癌BGC-823细胞增殖抑制率分别为（12.64±1.37）%，（41.86±2.14）%和（76.16±3.99）%。干预12～48 h，胃腺癌BGC-823细胞随干预时间延长与剂量增大，增殖抑制率逐渐增加（P<0.05）。见表1。

2.2 各组不同时间点人胃腺癌BGC-823细胞凋亡率比较 干预48 h时，对照组、低、中、高剂量实验组人胃腺癌BGC-823细胞凋亡率分别（4.97±1.54）%，（17.23±2.98）%，（37.24±4.67）%，（71.03±5.88）%。干预12～48 h，各组凋亡率随干预时间延长而逐渐升高;实验组凋亡率均较对照组显著升高，且随着BA剂量增大，凋亡率逐渐升高（P<0.05）。见表2。

2.3 各组人胃腺癌BGC-823细胞侵袭力比较 干预48 h时，对照组、低、中、高剂量实验组人胃腺癌BGC-823细胞侵袭率分别为（94.12±2.78）%、（71.35±2.23）%、（49.53±1.89）%、（31.68±1.47）%。与对照组比较，不同剂量实验组人胃腺癌BGC-823细胞侵袭率均显著降低，且呈剂量依赖性，差异有统计学意义（P<0.05）。见图1。

2.4 各组人胃腺癌BGC-823细胞P53、Caspase-3蛋白表达比较 对照组胃腺癌BGC-823细胞的胞质几乎不着色;实验组细胞出现淡黄色至棕黄色，且随着BA浓度的增加，颜色逐渐加深。见图2。干预48 h时，对照组、低、中、高剂量实验组人胃腺癌BGC-823细胞P53蛋白阳性细胞百分比分别为（11.12±1.01）%，（24.31±2.18）%，（47.56±2.91）%，（66.49±5.14）%;Caspase-3蛋白阳性细胞百分比分别为（15.04±1.23）%，（28.22±3.09）%，（69.36±5.42）%，（86.52±6.15）%。与对照组比较，不同剂量实验组P53蛋白及Caspase-3蛋白阳性细胞百分比均显著升高，且呈剂量依赖性，差异有统计学意义（P<0.05）。

3 讨论

花青素广泛存在于多种水果和蔬菜中，其中属蓝莓中的花青素含量最高。研究发现，蓝莓因含有花青素具有抗炎、抗氧化、抗癌及调节免疫等多种功效[10]。研究显示，BA可抑制结肠癌ls174t细胞增殖，诱导其凋亡，降低侵袭力，机制可能与上调P53蛋白表达和下调半胱氨酸蛋白酶-8（Caspase-8）蛋白表达有关[11]。有研究表明，BA对非小细胞肺癌A549细胞活力有明显的抑制作用，并可抑制其增殖，影响细胞周期[12]。也有研究表明，BA对人肝癌HepG2细胞有抑制增殖作用，其机制可能与增加组蛋白乙酰化修饰，促进细胞凋亡有关[13]。本研究结果显示，胃腺癌BGC-823细胞增殖抑制率随BA浓度增大而逐渐升高;且与对照组比较，低、中、高剂量实验组人胃腺癌BGC-823细胞凋亡率显著升高，而侵袭率降低，提示BA可有效抑制人胃腺癌BGC-823细胞增殖，诱导其凋亡，并降低侵袭能力。

在诱导凋亡的各种通路中，P53介导的凋亡通路在维持细胞稳定中起重要作用;Caspase-3是Caspase家族的关键酶，是凋亡过程中的效应蛋白。研究发现，BA可诱导结肠癌Lovo细胞发生晚期凋亡，其机制可能与P53基因mRNA表达上调有关[14]。也有研究发现，BA可以剂量依赖的方式抑制肝癌HepG2细胞的增殖，且BA处理组中Caspase-3蛋白的表达显著增加[15]。本研究结果显示，低、中、高剂量实验组P53蛋白及Caspase-3蛋白的阳性细胞百分比均显著显著高于对照组，且呈浓度依赖性，表明BA可上调P53蛋白及Caspase-3蛋白表达，诱导人胃腺癌BGC-823细胞凋亡。

综上所述，BA可显著抑制人胃腺癌BGC-823细胞增殖、侵袭能力，诱导其凋亡，同时上调P53蛋白及Caspase-3蛋白表达水平，发挥抗肿瘤作用，为BA的推广使用提供了实验依据。

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