李永平 张双照 薛珠政 温庆放

摘要：[目的]为开发高效的芥菜Brassicajuncea.分子标记。[方法]本研究通过对芥菜转录组测序的信息搜索SSR位点并分析其分布特点，应用Primer 3.0软件设计SSR引物，随机选择50对引物扩增44份芥菜种质，检测其多态性。[结果]芥菜转录组测序共获得55636条tmigene，全部序列有48193376bp;有7834条unigene包含SSR的序列，从中鉴定出9526个SSR位点，其中有1371条序列包含1个以上SSR，复合SSR有572个，SSR发生频率为14.08%。优势重复基序为三核苷酸和二核苷酸，分别占总SSR的51.12%和41.91%。二核苷酸重复基元中以AG/CT为优势重复基元，占总位点的34.74%，三核苷酸重复基元以AAG/CTT为主，占总位点的18.30%。共设计出21282对SSR引物，随机选择50对引物进行PCR扩增，其中41对扩增出清晰可重复的预期条带，17对（占34%）在44份芥菜种质中表现出多态性。应用UPGMA得到将44份供试材料分为4大类聚类图，可准确地体现了芥菜种质材料的关系。[结论]根据芥菜转录组数据能开发出类型丰富、效率较高的SSR标记，为芥菜亲缘关系分析和遗传图谱构建等提供更可靠的标记。

关键词：芥菜;转录组;SSR;多态性

中图分类号：S649文献标志码：A 文章编号：1008-0384（2020）02-0169-09

（研究意义）芥菜（Brassicajuncea）十字花科芸薹属植物，原产中国，并在中国发生丰富的变异和分化，全国有1000多份不同的芥菜品种。收集的种质资源混杂多样，因此对芥菜的种质资源的亲缘关系鉴定及分类意义重大，有利于提高芥菜种质的利用效率。（前人研究进展）目前对芥菜的起源进化、分类和遗传多样性已有研究。依据叶形态特征，如基生叶的裂刻、刺毛的有无、叶形的变化、茎与根的变异等，Vauzb8n等将芥菜划分了4个类群。孟秋峰等对17个芥菜变种植物学性状进行聚类，结果分为叶用芥菜、茎用芥菜、根用芥菜、薹用芥菜和籽用芥菜等5个类。（本研究切入点）微卫星序列（Simple sequence repeat，SSR）分子标记，在生物基因组中普遍存在，是一种可信赖的、使用方便分子标记之一，常用于作物遗传信息分析、品种鉴别、建立遗传图谱等。EST-SSR标记较基于基因组序列开发的SSR标记种间通用性更高，更经济方便。EST-SSR标记在辣椒、菜薹、菠菜、大白菜、甘蓝和洋葱等一些主要蔬菜作物中都有开发与应用，芥菜的EST-SSR标记开发利用未见报道。（拟解决的关键问题）本研究中应用转录组测序获得的数据进行SSR标记搜索，设计EST-SSR引物，评价引物的多态性效率，为芥菜种质遗传信息鉴定、遗传信息利用等开发可靠、高效的分子标记。

1 材料与方法

1.1转录组测序

测序材料“龙芥2号”于9月15日播种，lo月5日定植于福建省龙岩市新罗区龙门镇赤水村，11月5日，选取3株健康无病植株，每株选幼叶叶稍处取5g样品，液氮速冻，-80℃保存备用。广州基迪奥生物科技有限公司采用Illumina HiSeq TM 2500PEl25系统，设3个生物学重复进行转录组测序（无参），经过滤得到4.82G的有效RNA-seq数据。

1.2材料及其DNA提取

项目组收集的44份芥菜种质材料（表1）用于SSR引物筛选和有效性评价。供试材料基因组DNA用CTAB法提取。

1.3 SSR位点搜索及SSR引物设计

用MISA程序（http：//pgrc.ikp-gatersleben.de/misa）对转录组的所有Unigene进行搜索，寻找Unigene中的SSR，搜索参数为二、三、四、五、六核苷酸重复次数分别大等于6、5、5、4和4次且2個SSR序列的距离不短于100bp;用Primer 3.0软件对每条SSR设计3对引物并评价。引物要求为：序列长度18～25bp，GC含量40%～60%，上、下游引物的Tm值≤2℃，预期扩增产物100～400bp，不产生二聚体。

1.4 SSR引物筛选

20uLPCR反应体系：lommol·L^-1dNTPs0.4uL，5U Taq酶0.3uL，100ng DNA 1.0uL，10umol·L^-1的上、下游引物各0.8uL，10× Buffer（Mg²⁺）2.0uL，ddH₂O 14.7ul.PCR热程序如下：94℃5m;94℃30s，58℃30s，72℃ 30s，30个循环;72℃5min.PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳检测。

1.5 数据分析

SSR发生频率=SSR的unigene数量/总unigene数;SSR出现频率=SSR个数/总unigene数，SSR平均分布距离=unigene碱基数/SSR数。“1”：“0”法统计电泳数据，应用NTsys2.10e聚类分析。

2 结果与分析

2.1SSR的分布特征

芥菜转录组测序获得55636条unigene（总长约48193376bp），经MISA软件搜索发现9526个SSR位点发布于7834条unigene上。SSR发生频率14.08%，出现频率、17.12%，平均5.06kb有1个SSr.包含有二至六核苷酸重复类型，其中三核苷酸和二核苷酸重复是主要形式，分别占总SSR的51.12%与41.91%;其他3种苷酸重复类型数量较少共占总数的6.97%（表2）。

芥菜转录组SSR重复单元的重复次数最低4次，最高位42次，共有9241个SSR重复次数为4～10次，占总数的97.01%;285个SSR重复次数在11～42次，占总数的2.99%。芥菜转录组SSR的长度为12～324bp，主要集中于12～18bp，此长度间SSR达8230个，占总数的86.40%，长度大于18bp的SSR有1296个，只占13.60%。

2.2 转录组中SSR基序重复类型和频率特征

芥菜转录组的重复基序较为丰富，共有172种重复基序，分布见表3.AG/CT重复基序发生频率最高为34.74%，占二核苷酸重复的总数的82.89%;其次是AAG/CTT重复基序，发生频率为18.30%，占三核苷酸总数的35.79%。四核苷酸有25种重复基序、五核苷酸41重复基序、六核苷酸重复基序达92种，分布较散，发生的频率不高。

2.3 芥菜转录组SSR引物设计与筛选

遵照引物设计的标准，7834条含SSR位点的unigene序列，共设计得引物21282对。从不同核苷酸重复单元的引物中随机挑选50对，PCR扩增龙芥2号DNa.结果为50对引物均能扩增，其中4l对（82.00%）PCR扩增产物长度为100～400bp，9对（18%）扩增产物长度超400bp.

2.4多态性分析

用上述扩增产物与预期大小相符的41对引物扩增44份芥菜种质资源（图1），有17对（41.46%）引物具有特异性（表4）。17对多态性引物扩增46个多态性片段，平均每对引物扩增2.71个多态性片段。PIC值的大小代表多态性息的丰富程度，17对引物的PIC最高值达到0.82，平均值为0.60，仅BaSSR007、BaSSR043引物PIC值较低为0.43和0.47，表明这些17对芥菜SSR标记含有丰富的多态信息。17对多态性引物中二核苷、三核苷酸、五核苷重复的各4、6、3对，四核苷酸重复和六核苷酸重复的各2对。

对多态性SSR引物的扩增结果聚类分析，在遗传距离0.82处，44份芥菜种质材料被分成四大类（图2）。

第Ⅰ大类包括36个茎用、叶用芥菜材料;第Ⅱ大类包括5个结球芥材料：17、35、22、4l、43;第Ⅲ大类包括2个紫叶芥材料：2、42;第Ⅳ大类：薹芥品种38单独成类。第Ⅰ大类36个材料在遗传距离0.67处聚为4个亚类：（1）此亚类包含1、4、9、15、44、30、36、40、39、37、11等11个茎用材料和21、16、7、24、19、23、29、20、18等9个叶用材料;（2）含叶面有刺毛4个材料25、26、27、28;（3）此亚类包含5个株型半直立的材料32、31、12、33、34;（4）此亚类包含7个叶面平滑材料3、14、5、13、8、6、10.

3 讨论

高通量测序快速发展，EST数量得到迅速增加，为EST-SSR标记的开发应用提供了条件，许多植物的EST-SSR标记已被开发应用。芥菜EST-SSR标记的开发利用国内未见报道。本研究从芥菜的转录组测序结果的55636條unigene搜索获得7834条unigene序列共9526个SSR位点，SSR发生频率为14.08%，出现频率为17.12%。此结果较菠菜、洋葱、党参等4.33%～16，10%的频率范围略高，但低于菜薹19.26%和萝卜23.79%和的SSR位点频率。SSR发生频率与物种基因组差异、转录组测序的时期选择、获得数据量大小与质量、SSR搜索工具的选择及筛选的参数设置等因素密切相关。芥菜SSR含二、三、四、五、六核苷酸重复5种类型，以三核苷酸和二核苷酸重复为主要形式，分别占总SSR的51.12%与41.91%;四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重复类型数量较少，分别占总数的3.70%、1.40%和1.87%，与菜薹、芝麻、萝卜等作物的研究结果有所不同，这与SSR搜索参数设置有关。二、四和五核苷酸重复多在非翻译区（UTR），三、六核苷酸重复与编码序列（CDS）密切相关，芥菜三核苷酸重复SSR占绝对优势，说明芥菜转录组unigene中的CDS信息更丰富。AAG/CTT和AG/CT重复基序在众多基序占优势，与在大白菜、黄秋葵的结果一致。选取的50对SSR引物扩增‘龙芥2号DNA，9对（18%）引物扩增产物超预期，扩增不成功的因素可能是引物内含子在启动位点引起SNPS/InDel变异，或是组装错误。多态性引物占有效引物的41.46%，低于洋葱（45.00%），高于辣椒（36.84%）、菠菜（17.43.00%），说明所设计的芥菜SSR标记引物多态性较好。有研究认为，SSR标记的多态性可能与重复序列长度呈正相关，重复序列长于20bp的SSR，表现多态性的概率高;重复序列长度小于20bp的SSR呈多态性的可能性明显较低。本研究中17对多态性引物仅有2对来自于长度小于20bp重复序列。PIC值可用于衡量标记的多态信息，本研究中17对多态引物的平均PIC值为0.60，最低值0.43发生在重复序列最短序列的引物BaSSR007上，15对引物PIC值均大于0.5，结果说明本研究开发的芥菜EST-SSR有较高的多态性。

李宁等用SRAP标记将111份芥菜归为薹芥、叶用芥和茎用芥、紫叶芥和长柄芥5类，遗传相似系数为0.38～0.89，表明芥菜在分子水平上遗传多样性较丰富。本研究应用EST-SSR标记分类44份芥菜种质材料的结果与其相似，但与运用AFLP、RAPD、ISSRL等标记研究的结果不尽相同，这可能与不同分子标记所揭示的基因组片段的变异方式不同有关。

RAPD、ISSR、SRAP等标记技术均开发于无基因组（或转录组）序列信息，随机性强、稳定性差。EST-SSR来自基因的转录区并与功能基因紧密连锁，具有丰富多态性，较高灵敏度，可重复性强等优势。本研究利用基于芥菜转录组数据筛选得17对SSR引物，对44份芥菜种质材料进行遗传多样性分析，以遗传距离0.82为阈值，44份芥菜种质材料分为四大类，SRAP标记等无法将结球和不结球芥菜完全分开，而SSR标记可以准确分开，较ISSR、SRAP等标记的分析结果，SSR标记更准确地体现了芥菜种质材料的关系。