林裕胜 江锦秀 张靖鹏 游伟 胡奇林

摘要：[目的]比较分析羊口疮病毒疫苗株与ORFV-PN株ORFV011基因的分子特点、编码蛋白的生物学功能差异，为福建省羊口疮的科学防控提供理论指导。[方法]对羊口疮疫苗株和ORFV-PN株ORFV011基因进行克隆和测序，运用生物信息学相关软件比较分析两者测序结果的差异。[结果]测序结果显示，疫苗株和ORFV-PN株ORFV011基因均由1137个核苷酸组成，编码378个氨基酸。核苷酸序列和氨基酸序列相似性比较显示，ORFV-PN与疫苗株和弱毒株D1701株ORFV011基因核苷酸序列相似性分别为98.6%和98.4%，氨基酸序列相似性均为98.7%。与疫苗株相比，ORFV-PN株共有16处核苷酸变异和5处氨基酸变异。在蛋白二级结构上，ORFV-PN株和疫苗株。α-螺旋占比分别为34.13%（129/378）和30.42%（115/378），β-转角占比分别为6.08%（23/378）和6.88%（26/378），无规则卷曲占比分别为37.30%（141/378）和39.15%（148/378），β-折叠占比分别为22.49%（85/378）和23.54%（89/378）。蛋白三级结构上，ORFV-PN株预测的三维结构与疫苗株的三维结构在α-螺旋和无规则卷曲上有一定的差异。[结论]福建省羊口疮病毒ORFV011基因出现变异，应当引起广大兽医工作者的重视，有关部门应当加强对羊口疮的监测。

关键词：羊口疮病毒;疫苗株;ORFV-PN;ORFV011基因

中图分类号：S 852.659.1文献标志码：A 文章编号：1008-0384（2020）02-0124-06

0 引言

（研究意义）羊口疮病毒（Orfvirus，ORFV）是一种变异性较强的病毒，病毒基因组长度因毒株不同而有所区别。ORFVOll基因编码的B2L蛋白是重要的免疫原性蛋白，是研究羊口疮（Orf）新型疫苗的重要靶基因。通过比较分析羊口疮病毒疫苗株和地方分离株ORFVOll基因的分子特点、编码蛋白的生物学功能，可为福建省羊口疮的诊断、流行病学调查及疫苗选择提供理论依据。（前人研究进展）羊口疮是羊口疮病毒引起的一种接触性人兽共患传染病，该病的发病率在4%～100%，死亡率1%～59%不等。ORFV011基因全长为1137bp，编码42kDa左右蛋白，可刺激机体产生强烈的抗体反应。ORFVOll基因位于基因组中部高度保守区域，保守性较强，常利用该基因建立PCR诊断方法及分子流行病学调查。Wang等根据ORFVOll基因建立了SYBR GreenI实时荧光定量PCR检查方法;Wang等根据ORFVOII基因对安徽省羊口疮病毒分离株进行鉴定及遗传变异分析。从近年来ORFVOll基因分子遗传特征的报道来看，该基因已经出现一定程度的变异，如Nagaraian等研究发现印度分离株的ORFV011基因与羊口疮病毒、伪牛痘病毒和牛丘疹性口炎病毒的同源性分别为98.14%、96.29%和83.59%。王秋霞等通过对江苏省羊口疮病毒的分离鉴定及ORFV011基因的遗传进化分析结果显示，4株分离株ORFVOll基因与疫苗株的同源性仅有96.8%～98.1%，暗示羊口疮病毒已经出现一定程度的变异。（本研究切入点）已有研究人员对羊口疮病毒疫苗株和地方分离株FIL基因进行了比较分析，然而对于疫苗株和地方分离株的ORFVOll基因对比研究尚未见报道。（拟解决的关键问题）本研究通过对羊口疮病毒疫苗株和ORFV-PN株ORFVOll基因进行克隆测序，对国内外不同分离株间ORFVOll基因核苷酸序列、其推导的氨基酸序列和编码蛋白质结构进行比较分析。

1 材料与方法

1.1 样品来源

福建省内某疑似患羊口疮的羊唇部痂皮组织利用羊睾丸原代细胞分离鉴定后，命名为ORFV-PN株。

1.2 试验材料

羊口疮弱毒疫苗购自山东泰丰生物制品有限公司，DH5a感受态和DNA/RNA提取试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司，质粒小量提取试剂盒、胶回收试剂盒购自湖南艾科瑞生物工程有限公司;限制性内切酶BarnHI和SalI购自NEB公司;DNAMarker DL2000、DL 5000采购自TaKaRa公司;pMC100-M载体购自武汉齐美欣科生物技术有限公司;1-5Hi-Fi DNA polvmerase高保真酶购自MCLAB公司。

1.3 引物的设计合成

通过下载GenBank中公布的ORFVOll基因序列（GenBank登录号：DQl84476），利用Olig07.0软件结合参考文献[12]设计1对扩增ORFVOll基因全长的特异性引物，在引物两端添加酶切位点，引物由福州白鲸生物股份有限公司合成。上游引物ORFV011F：5-CGGGATCCATGTGGCCGTTCTCCTCCA-3;下游引物ORFV011R：5-GCGTCGACTTAATTTATTGGCTTGCAGAACT-3'，划线部分分别为BamHI和SalI内切酶。

1.4 疫苗株与ORFV-PN株病毒DNA的提取和常规PCR扩增

利用全式金病毒DNA/RNA提取试剂盒分别提取疫苗株和ORFV-PN株DNA，冻存于-20℃冰箱。疫苗株和ORFV-PN株PCR反应体系均为40uL：1-5Hi-Fi DNApolymerase 20uL，模板6uL，上、下游引物（10umol·L^-1）各2uL，ddH₂O 10ul.反應程序：95℃、3min;95℃、15s，55℃、

15s，72℃、15s，30个循环;72℃、5min.

1.5 疫苗株和ORFV-PN株ORFVOll基因克隆测序

将凝胶电泳上条带正确的片段利用胶回收试剂盒进行切胶回收，回收产物与pMCl00-M载体进行连接，连接后的产物转化至DH5a感受态细胞中，涂布LB平板，将涂布后的平板放人37℃培养箱中培养24h后，挑取单个菌落进行培养，利用质粒提取试剂盒提取培养菌质粒，进行PCR和双酶切验证。将验证正确的质粒送往福州尚亚生物技术有限公司进行测序。

1.6 疫苗株和ORFV-PN株ORFVOll基因核苷酸和氨基酸序列比较

疫苗株和ORFV-PN株测序结果利用生物信息学软件进行比对，比较两者在核苷酸和氨基酸水平上的突变情况;同时将测序结果与GenBank上已公布的国内外主要毒株（表1）的ORFVOll基因序列进行比对分析。

1.7 疫苗株和ORFV-PN株ORFV01l蛋白质一级结构与功能的比较分析

将疫苗株和ORFV-PN株ORFVOll基因克隆测序后正确的核苷酸序列翻译成氨基酸后分别上传至在线软件ProtParam、NCBI-Conserved Domain ArChltcctuIcRetrieval Tool、TMHMM2.0、SignalIP 5.0和NetNGlyc1.0Server中，对两者的氨基酸组成和理化性质、保守结构域、跨膜区、信号肽及糖基化位点进行分析。

1.8 疫苗株和ORFV-PN株ORFV01l蛋白质二级结构与功能的比较分析

利用Lasergene软件和SOPMA在线软件对疫苗株和ORFV-PN株ORFV01l蛋白的亲水性、疏水性、抗原指数、α-螺旋、β-转角、无规则卷曲和β-折叠的占比等进行对比分析。

1.9 疫苗株和ORFV-PN株ORFV01l蛋白质三级结构分析

分别将疫苗株与ORFV-PN株的ORFVOll基因推导的氨基酸序列上传至Swiss-Model在线软件进行蛋白3D结构预测，预测结果运用Swiss-PDB-Viewer软件进行分析。

2 结果与分析

2.1 疫苗株和ORFV-PN株ORFVOll基因的扩增及重组质粒双酶切

分别以提取的疫苗株和ORFV-PN株的DNA为模板进行PCR扩增，在凝胶成像系统下可见疫苗株和ORFV-PN株在1000bp左右有明显片段，与预期片段大小相一致（图1）。将疑胶电泳上条带正确的片段利用胶回收试剂盒进行切胶回收，回收产物与PMC100-M载体进行连接，连接后的产物转化至DH5a感受态细胞中，涂布LB平板，LB平板放人37℃培养箱中培养24h后挑取单个菌落进行培养，利用质粒提取试剂盒提取质粒，提取的质粒用BamHI和Sal I进行双酶切，酶切后得到两个片段，一个约为2300bp，与pMCl00-M大小相等，另一个片段约为1100bp，与目的片段大小一致（图2）。

2.2 疫苗株和O～V-PN株ORFV011基因序列测定分析

将疫苗株和ORFV-PN株ORFVOll基因阳性质粒送往福州尚亚生物技术有限公司进行测序，测序结果利用DNAStar和MEGA7.0软件进行比较分析。测序结果显示：疫苗株和ORFV-PN株ORFVOll基因均为1137bp，编码379个aa.核苷酸和氨基酸同源性比对结果为：疫苗株与ORFV-PN株的核苷酸序列同源性为98.6%;与疫苗株相比，ORFV-PN株共有16处核苷酸差异，分别为32位碱基C突变为G，42位碱基C突变为T，201位碱基G突变为A，238位碱基G突变为A，301位碱基G突变为A，315位碱基G突变为A，367位碱基A突变为C，369位碱基A突变为C，375位碱基A突变为G，636位碱基A突变为G，660位碱基G突变为A，822位碱基G突变为A，840位碱基G突变为A，897位碱基C突变为T，1044位碱基G突变为A，1119位碱基C突变为T;疫苗株和ORFV-PN株氨基酸序列同源性为98.7%，与疫苗株相比，ORFV-PN株共有5处氨基酸差异，分别为11位氨基酸G突变为A，80位氨基酸I突变为V，100位氨基酸I突变为V，123位氨基酸L突变为I，126位氨基酸A突变为t.疫苗株和ORFV-PN株ORFVOll基因的核苷酸序列和氨基酸序列与国内外毒株的相似性分别为96.9%～99.4%和97.8%～99.1%，其中ORFV-PN株与弱毒株D1701核苷酸和氨基酸序列相似性分别为98.4%和98.7%，可见不同地区分离株ORFV011基因有一定差异。通过MEGA7.0构建遗传进化树发现，本研究中的ORFV-PN株ORFVOll基因氨基酸与新疆毒株KF666565、山西毒株HQ202153同源性最高，同时与贵州毒株KP994595较接近，处在同一进化分支上，与疫苗株和弱毒株D1701相距较远（图3）。

2.3 疫苗株和ORFV-PN株ORFV01l蛋白质一级结构、理化性质和保守结构域分析

将疫苗株和ORFV-PN株ORFVOll基因推导的氨基酸序列分别上传至Expasy在线软件进行分析，从分析结果可知，疫苗株和ORFV-PN株ORFV011蛋白的相对分子质量分别为41.67和41.69kDa，理论等电点均为6.01;ORFV-PN株脂肪族氨基酸指数和亲水性指数与疫苗株相比均变小。利用TMHMM2.0在线软件和SignalP 5.0在线分析结果显示，疫苗株和ORFV-PN株ORFV011蛋白均无跨膜区和信号肽。利用NetNGlYc 1.0Server在线软件对疫苗株和ORFV-PN株ORFV011蛋白进行糖基化位点预测，结果显示均有4个糖基化位点，没有发生变化。经NCBI-Conserved Domain Architecture Retrieval Tool在线分析疫苗株和ORFV-PN株ORFV011蛋白的保守性结构域发现，疫苗株和ORFV-PN株ORFV011蛋白均含有2个磷脂酶D超家族的保守结构域以及对应的特异性结合位点。

2.4 疫苗株和ORFV-PN株ORFVOll蛋白高级结构及功能分析

通过Lasergene软件中Protean程序对疫苗株和ORFV-PN株ORFV011蛋白二级结构进行分析，结果（图4）显示：疫苗株和ORFV-PN株ORFV011蛋白抗原位点均分布在60～120、160～180、200～220、260～279位氨基酸，具有較好的柔韧性，前3个抗原可及性较高。由表2可知，疫苗株和ORFV-PN株ORFV01l蛋白二级结构中。α-螺旋、β-折叠和无规则卷曲较多，其中ORFV-PN株。α-螺旋比疫苗株多14个，β-转角、β-折叠和无规则卷曲比疫苗株分别少3个、7个和4个。通过Swiss-Model在线软件提交疫苗株与ORFV-PN株ORFV01l蛋白序列进行三维结构的预测，从造模结果发现，与磷酸酯酶D（PhosphollpaseD）结构相似性最高，与蛋白结构域预测结果相同。由图5（箭头所指位置）可以看出，疫苗株和ORFV-PN株ORFV01l蛋白的三维结构有一定的差异，与二级结构预测结果一致，具体体现在无规则卷曲的程度和α-螺旋的长度上。

3 讨论

疫苗接种是控制传染病发生的有效手段之一。目前国内外对羊口疮的预防主要是通过接种弱毒苗。然而，由于羊口疮病毒弱毒苗接种方法的特殊性，以及各地使用疫苗免疫后效果不理想，出现免疫失败和重复感染，近年来出现了关于羊口疮病毒弱毒苗是否能够提供有效保护的疑惑。

据报道，ORFVOll基因编码约42kDa的蛋白具有良好的免疫原性，可以刺激机体产生强烈的抗体反应。此外ORFVOll基因常被用作遗传进化树分析，是作为羊口疮病毒分子流行病学研究的参考对象之一。对福建省地方株和疫苗株ORFVOll基因的分子特征及蛋白结构的比较分析，可为福建省羊口疮的诊断、流行病学调查及疫苗选择提供理论依据，同时有助于阐明羊口疮病毒的致病机制。

本研究通过对市面上购买的商品化羊口疮病毒疫苗弱毒株和福建省ORFV-PN株提取DNA，利用设计的特异性引物扩增ORFVOll全基因，将扩增产物进行胶回收，转化至基因工程菌中，将阳性克隆子送生物技术公司测序，利用生物信息学软件对测序后的核苷酸序列和蛋白结构进行比较分析。核苷酸序列和氨基酸序列相似性比较显示，ORFV-PN与疫苗株和弱毒株D1701株ORFVOll基因核苷酸序列相似性分别为98.6%和98.4%，氨基酸序列相似性均为98.7%，与疫苗株相比，ORFV-PN株共有16处核苷酸变异和5处氨基酸变异，该结果与李智、E1-Tholoth、ZHANG等研究结果一致。在蛋白一级结构上，疫苗株和ORFV-PN株ORFV01l蛋白均有4个糖基化位点，位点未发生转移或突变;两者均无信号肽，表明ORFV01l为非分泌蛋白;亲水性区域和理论等电点均相同，但相对分子质量却不同，这与氨基酸的点位突变有关。在蛋白二级结构上，ORFV-PN株和疫苗株的抗原位点差异甚小，但在α-螺旋、β-转角、无规则卷曲和β-折叠数量上存在一定的差異，ORFV-PN株和疫苗株。α-螺旋占比分别为34.13%和30.42%，β-转角占比分别为6.08%和6.88%，无规则卷曲占比分别为37.3%和39.15%，β-折叠占比分别为22.49%和23.54%;蛋白三级结构上ORFV-PN株预测的三维结构与疫苗株的三维结构在α-螺旋和无规则卷曲上有一定的差异，三级结构上的差异与二级结构预测相一致。

本研究运用多种生物信息学软件对羊口疮病毒疫苗株和福建ORFV-PN株ORFVOll基因及编码的蛋白在分子特征以及蛋白结构功能方面进行分析，结果显示，福建省羊口疮病毒已出现一定的变异，应当引起广大兽医工作者和有关部门的重视，加强对羊口疮的监控。