邓 祥，黄小梅

(四川文理学院 化学化工学院，四川 达州 635000)

贝母(Fritillaria)为百合科贝母属多年生草本植物，以鳞茎入药[1].贝母因其形状而得名，形似聚贝子，故称其为贝母[2].贝母主要产于四川、浙江、陕西秦巴山区、新疆等地，分别称之为川贝母、浙贝母、土贝母、伊贝母[3].川贝母(Bulbus Fritillariae Cirrhosae)作为一种名贵的中药材，具有悠久的使用历史，早在汉代《神农本草经》中就有记载，是贝母中的珍品，为代表性川产道地中药材之一[4-6].川贝母中药材具有清热润肺、开郁散结、解毒消痈、化痰止咳之功效，主要用于治疗肺热燥咳、干咳少痰、痰多胸闷、阴虚劳嗽、咯痰带血等症状[7-8].川贝母含有黄酮类、多酚类、多糖类、生物碱类以及皂苷类等有效成分[9-10].大量研究表明：川贝母提取物药效成分除与生物碱类和皂苷类化合物有关外，还与其黄酮类化合物有关[11-12].因此，研究川贝母中药材中黄酮类物质的有效含量，有利于判明川贝母潜在的药用价值和开发利用前景.

目前，黄酮类物质的提取方法主要有溶剂浸提法、超声波辅助提取法、树脂吸附分离法、复合酶提取法、微波辅助提取法、超临界CO2萃取法等[13].其中超声波辅助提取法是近年来发展起来的一种中药材提取技术，是利用超声波强烈的机械振动效应、扰动效应和空化效应等作用，增加溶剂的穿透力以及分子运动的速度和频率，从而加速目标物溶解，达到高效提取的目的[14-15].本实验采用超声波提取技术，旨在对四川达州万源产贝母中黄酮类物质进行含量检测和提取工艺优化研究，为川贝母的进一步开发利用提供科学依据.

1 材料与仪器

1.1 材料与试剂

川贝母(四川达州万源产)，40 ℃恒温干燥后，粉碎过40目的筛子得川贝母粉末备用；芦丁标准对照品(阿拉丁试剂)；无水乙醇、硝酸铝、氢氧化钠、亚硝酸钠等(上海试剂二厂)，其余试剂均为分析纯；实验用水均为超纯水.

1.2 主要仪器设备

VOSHIN-1500C型低温超声波萃取仪(无锡 沃信)；UV-2550紫外可见分光光度计(日本 岛津)；ESJ200-4A型全自动电子分析天平(沈阳 龙腾)；JIDI-20D台式多用途高速离心机(广州 吉迪)；101-3AB型电热鼓风干燥箱(天津 泰斯特)；WK-400B型高速中药粉碎机(青州 迈德森)；40目不锈钢筛子.

2 方法与实验

2.1 标准曲线的绘制

以芦丁为标准试剂，5% NaNO2、10% Al(NO3)3、1 mol/L NaOH为显色剂，采用Al(NO3)3- NaNO2比色法测定黄酮含量[16].首先准确称取芦丁标准对照品20.0 mg，再用50%乙醇溶液溶解并定容到100 mL，得0.2 g/L的芦丁对照品储备液.分别准确移取0、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 mL上述对照品储备液于不同25 mL容量瓶中，再依次分别加入50%乙醇至容量瓶的一半，1.0 mL 5%的亚硝酸钠溶液，1.0 mL 10%的硝酸铝溶液，5.0 mL 1 mol/L氢氧化钠溶液，50%乙醇定容，每次加入溶液摇匀后静置10 min.以空白作为对照，在510 nm处测定吸光度.每个点的数据分别测定3次求平均值，以芦丁浓度ρ为横坐标，吸光度为纵坐标绘制准曲线，见图1.

图1 芦丁标准曲线Fig.1 Standard curve of rutin

2.2 黄酮的提取及测定

将川贝母掰成小片，在40 ℃条件下恒温干燥，经粉碎后过40目筛，得到川贝母粉末.准确称取0.5 g(M)川贝母粉末于离心管中，取一定量不同浓度的乙醇做溶剂，用超声波萃取仪重复提取2次，通过高速离心后，将上层清液收集到容量瓶中，用相应提取溶剂定容(V0)，再精确移取定容后的提取液5.0 mL(V1)于25.0 mL(V)容量瓶中，按2.1的方法处理，取待测样品溶液，测定510 nm处的吸光度，代入标准曲线线性方程求川贝母黄酮类物质的提取浓度(C)，计算川贝母黄酮类物质的提取率(W)：W=(C×V×F)/M.其中，W为黄酮类物质的提取率，mg/g；C为黄酮类物质的提取浓度，g/L；F=V0/V1为溶液稀释倍数；V为溶液体积，mL；M为样品质量，g.

2.3 正交试验设计

根据单因素实验结果，进一步优化各因素对川贝母黄酮类物质提取率的影响，固定超声功率不变，对乙醇体积分数、料液比、超声时间和超声温度四个变量进行条件优化，根据正交试验原理设计了L9(34) 正交试验，其因素水平关系见表 1所示.经试验数据分析，最后通过实验验证得出黄酮类物质超声波提取最优条件.

表1 因素及水平

3 结果与讨论

3.1 紫外-可见吸收波长的确定

通过萼贝提取得到的待测样品和芦丁标准品，对其进行了紫外-可见吸收光谱测试，如图2所示.芦丁标准品在显色前没有出现特征吸收峰，如图2(c)所示.显色后，芦丁标准品在510 nm处出现特征吸收峰，其峰值位于450和600 nm之间，如图2(a)所示.萼贝提取得到的待测样品在显色前也没有出现特征吸收峰，如图2(d)所示.显色后，样品也在510 nm处出现特征吸收峰，如图2(b)所示.因此可以采用芦丁标准品作为对照检测萼贝提取物中的黄酮类物质，其紫外-可见吸收光谱特征吸收峰为510 nm.

图2 紫外-可见吸收光谱图Fig.2 UV-Vis absorption spectra

3.2 单因素实验

3.2.1 超声功率对提取率的影响

称取川贝母粉末0.5 g，加入无水乙醇15.0 mL，在超声温度40 ℃条件下超声提取1.5 h，并重复提取2次，按2.2的方法处理，并计算出川贝母黄酮类物质的提取率，考察超声功率对川贝母黄酮类物质提取率的影响，其结果如图3所示.

图3 超声功率的影响Fig.3 Effect of ultrasonic power

从图3可以看出，在所测定的超声功率范围内，川贝母黄酮类物质的提取率逐渐增大，当超声功率达到800 W时，川贝母黄酮类物质的提取率达到最大值并趋于稳定.所以，为了节约能源，达到绿色化学的要求，选择800 W为最佳超声功率.

3.2.2 乙醇体积分数对提取率的影响

称取川贝母粉末0.5 g，加入不同体积分数的乙醇溶液15.0 mL，在超声功率800 W和超声温度40 ℃条件下超声提取1.5 h，并重复提取2次，考察乙醇体积分数对川贝母黄酮类物质提取率的影响，其结果如图4所示.

图4 乙醇体积分数的影响Fig.4 Effect of ethanol volume fraction

由图4可知，在所测定的乙醇体积分数范围内，川贝母黄酮类物质的提取率先随着乙醇的体积分数的增加而随之增大，但当乙醇的体积分数超过80%时，川贝母黄酮类物质的提取率开始降低.这可能是因为当乙醇浓度较低时，黄酮类物质的溶出率较小，而随着乙醇的浓度的增大，黄酮类物质的溶解度也随之增大，但增大到一定的程度时，黄酮类物质与其他有机物竞相溶出，相互竞争，黄酮类物质的溶解度反而降低，所以，为了达到最优条件应将乙醇的体积分数定为80%.

3.2.3 料液比对提取率的影响

称取川贝母粉末0.5 g，加入不同体积的80%乙醇溶液，在超声功率800 W和超声温度40 ℃条件下超声提取1.5 h，并重复提取2次，考察料液比对川贝母黄酮类物质提取率的影响，其结果如图5所示.

图5 液料比的影响Fig.5 Effect of material-solvent ratio

由图5可知，在所测定的料液比范围内，川贝母黄酮类物质的提取率先随着乙醇用量的增加而随之增大，但当料液比达到1 g∶40 mL之后，黄酮类物质的提取率趋于稳定.这是因为乙醇用量较小时，黄酮类物质不能充分溶解在溶剂中，随着溶剂用量的增大，黄酮类物质的溶解度增大，但随着溶剂量的进一步增加，过量的溶剂已经不能对川贝母黄酮类物质的提取产生影响，于是黄酮类物质的提取率趋于稳定.因此确定川贝母黄酮类物质超声提取的最佳料液比为1 g∶40 mL.

3.2.4 超声时间对提取率的影响

称取川贝母粉末0.5 g，加入80%乙醇溶液20.0 mL，在超声功率800 W和超声温度40 ℃条件下进行超声提取，并重复提取2次，考察超声时间对川贝母黄酮类物质提取率的影响，其结果如图6所示.

图6 超声时间的影响Fig.6 Effect of ultrasonic time

从图6可以看出，川贝母黄酮类物质的提取率逐渐增大，但当超声时间超过2 h后，黄酮类物质的提取率略有下降.这可能是因为超声时间比较短时，黄酮类物质在乙醇中的溶解不充分，随着超声时间的延长，黄酮类物质溶解的越来越充分，但超声时间过长，其他组分也逐渐被提取出来，反而抑制了黄酮类物质的提取，提取效率反而降低.所以，当超声时间为2 h时，川贝母黄酮类物质的提取率最大.

3.2.5 超声温度对提取率的影响

称取川贝母粉末0.5 g，加入80%乙醇溶液20.0 mL，在超声功率800 W条件下超声提取2.0 h，并重复提取2次，考察超声温度对川贝母黄酮类物质提取率的影响，其结果如图7所示.

图7 超声温度的影响Fig.7 Effect of ultrasonic temperature

由图7可知，在所测定的温度范围内，川贝母黄酮类物质的提取率先随着温度的升高而逐渐增加，但当超声温度超过45 ℃之后，黄酮类物质的提取率随之下降.这是因为温度越高，分子热运动越快，黄酮类物质的提取率越高，又由于在高温下，黄酮类物质不稳定，容易部分分解或氧化，此时随着温度的升高，川贝母黄酮类物质的提取率反而下降.因此川贝母黄酮类物质的最佳超声温度为45 ℃.

3.3 正交试验

根据正交实验因素水平表和单因素实验结果，在固定超声功率800 W不变的情况下，对乙醇体积分数、料液比、超声时间和超声温度四个因素，设计了四因素三水平L9(34) 正交试验，其结果见表2所示.

表2 正交试验

由表2可知，通过极差R大小进行比较分析，可以判断超声温度(D)和料液比(B)对川贝母黄酮类物质的提取率有显著影响，其次是超声时间(C)，最后是乙醇体积分数(A).通过均值k进行比较分析，得出其最佳提取工艺条件为：A2B3C2D2，即乙醇体积分数为80%，料液比为1 g∶45 mL，超声时间为2.0 h，超声温度为45 ℃.

3.4 验证试验

根据单因素实验和正交试验结果，在固定超声功率800 W不变条件下，设计五组重复操作实验进行验证，验证试验结果见表3所示.最佳提取工艺条件下，川贝母黄酮类物质的提取率约为77.13 mg/g，根据测定结果计算相对标准偏差(RSD)值为0.39%.

表3 验证试验

3.5 加标回收实验

称取川贝母粉末0.5 g，按最佳提取工艺条件进行提取，经处理后按所建立的实验方法进行检测，采用加标回收法做回收率实验，其结果见表4.从表中可以看出，本方法对检测苦味酸的回收率和RSD分别为97.48%～103.84%和0.95%～1.72%.

表4 芦丁加标回收实验

4 结论

本研究以中药材川贝母为原料，采用超声波提取技术，实现了对川贝母黄酮类物质的有效提取.探讨了超声功率、乙醇体积分数、料液比、超声时间和超声温度等单因素对川贝母黄酮类物质提取率的影响，在固定超声功率800 W条件下，通过正交试验对川贝母黄酮类物质的提取条件参数进行了优化，建立了川贝母黄酮类物质的超声波最佳提取工艺参数：超声功率800 W，乙醇体积分数为80%，料液比为1 g∶45 mL，超声时间为2.0 h，超声温度为45 ℃.根据最佳提取工艺参数进行了验证试验，川贝母黄酮类物质的提取率达到77.13 mg/g，RSD值为0.39%.当加入5.00、20.00、80.00 mg芦丁标准品到0.5 g川贝母提取液中，加标回收率和RSD分别为97.48%～103.84%和0.95%～1.72%.