★ 刘建群 罗素花 杨瑞昆 闫君 舒积成 张锐

（江西中医药大学现代中药制剂教育部重点实验室 南昌 330004）

雷 公 藤（Triptergium wilfordii Hook.f.）系 卫矛科雷公藤属植物，含有二萜、三萜、生物碱等类化学成分，具有抗炎、免疫抑制、抗肿瘤等多种活性［1］。雷公藤在治疗类风湿关节炎、肾小球肾炎、银屑病等自身免疫性疾病方面效果显著［2］。雷公藤及其有效成分雷公藤甲素、雷公藤红素及生物碱等毒副作用较大，雷公藤是不良反应报道最多的中草药之一，这大大限制其临床应用［3-5］。有毒中药一直是中药炮制研究的重点，《神农本草经》云“有毒宜制”。笔者前期研究发现雷公藤经200℃烘箱煨制后有显著的减毒增效作用［6-7］，而雷公藤经微波煨制后虽然毒性显著下降，但是基本丧失了抗炎活性［7-8］。我们还总结了炮制对雷公藤毒效及其化学成分的影响，研究表明应加强较有前景的雷公藤煨制、米醋蒸和莱菔子汁制炮制的深入研究，加强雷公藤炮制传统理论研究，炮制对雷公藤的性味、归经和功能主治的影响研究等［9］。为阐明雷公藤煨制减毒增效物质基础，提高雷公藤临床应用的安全性，我们采用紫外分光光度法测定了雷公藤200℃烘箱煨制后化学成分含量变化，结果表明煨制后总二萜、总三萜和总生物碱的含量显著下降，其中总生物碱降幅最大［10］。采用UPLC-Q-TOF MS 技术结合主成分分析鉴定了煨制后发生显著变化的35 个成分，其中大部分是生物碱，其次是三萜［11］。为进一步阐明雷公藤煨制减毒增效物质基础，本文采用HPLC-DAD 方法对雷公藤煨制后化学成分的变化进行了系统分析鉴定。

1 材料与仪器

1.1 实验材料 雷公藤药材采自江西省萍乡市，原植物经江西中医药大学付小梅教授鉴定为卫矛科植物雷公藤（Triptergium wilfordii Hook.f.）。

甲醇（色谱纯，DIKMA 公司），甲酸（色谱纯，阿拉丁公司），乙腈（色谱纯，ACS 公司），双蒸水（自制），其他试剂均为分析纯。对照品雷公藤次碱、雷公藤吉碱、去甲泽拉木醛和雷公藤红素（含量均大于98%，郑州丰耀农业科技有限公司），对照品南蛇藤肉桂酰胺碱、1-羟基-2， 5， 8-三甲基-9-芴酮、25（9 →8），26（13 →14）Abeo-24-nor-8，14-seco-friedelan-2，3-dihydroxy-1，3，5（10），6，8-pentaen-29（13）-olide 和雷公藤定碱（本实验室分离制得，经HPLC 检测含量均大于98%）。

1.2 实验仪器 Agilent 1260 高效液相色谱仪（Agilent 公 司）；BT25S 型 电 子 天 平（1/10 万，Sartorius）；BS224S 型电子天平（1/1 万，Sartorius）；GZX-9140 MBF 数显鼓风干燥箱（上海博讯实业有限公司）；PS-40 洁康超声仪（东莞市洁康超声波设备有限公司）。

2 方法与结果

2.1 供试品溶液的制备

2.1.1 雷公藤药材及其煨制品溶液的制备 称取雷公藤根药材2 份，每份10g，分为生品组和200℃煨制品组。煨制品按以下方法制备：取黄土晒干研磨后过4 号筛，与10%食盐水按每4g 黄土中加入1ml 食盐水的比例和匀，将锡箔纸包住的10g 药材用黄泥均匀包裹，包层厚度约3mm，置于200℃的烘箱中煨制45min，取出，剥离黄泥，得8.7g 雷公藤煨制品。将10g 雷公藤生品和8.7g 的雷公藤煨制品粉碎，分别用100ml甲醇超声提取30min，静置，取上清液1ml，过0.22um 有机滤膜，得生品组和煨制品组样品溶液。

2.1.2 雷公藤总生物碱及其煨制品溶液的制备 精密称取雷公藤药材（粉碎过三号筛）约40g。加95%乙醇700ml，超声提取30min，取出，滤过，滤液减压蒸干。残渣加盐酸溶液（1 →100）300ml 溶解，滤过。滤液加10ml 浓氨水试液调节pH 值至9，用乙醚400ml 振摇萃取，乙醚液挥干，得到总生物碱。精密称取总生物碱2 份，每份12mg。一份用10ml甲醇溶解，过0.22um 有机滤膜，得总生物碱样品溶液。另一份按照上述“2.1.1”方法煨制后，再用10ml 甲醇溶解，过0.22um 有机滤膜，得总生物碱煨制品溶液。

2.1.3 雷公藤红素及其煨制品溶液的制备 精密称取雷公藤红素对照品两份，每份13mg。一份用10ml 甲醇溶解，过0.22um 有机滤膜，得雷公藤红素样品溶液。另一份按照上述“2.1.1”方法煨制后，再用10ml 甲醇溶解，过0.22um 有机滤膜，得雷公藤红素煨制品溶液。

2.1.4 混合对照品溶液的制备 精密称取雷公藤次碱，雷公藤吉碱，雷公藤定碱对照品适量，分别用甲醇溶解，配成质量浓度为30μg/mL 的混合对照品溶液1。精密称取南蛇藤肉桂酰胺碱，25（9 →8），26（13 →14）Abeo-24-nor-8，14-seco-friedelan-2，3-dihydroxy-1，3，5（10），6，8-pentaen-29（13）-olide，去甲泽拉木醛， 1-羟基-2，5，8-三甲基-9-芴酮，用甲醇溶解，配成质量浓度为30μg /mL 的混合对照品溶液2。

2.2 HPLC-DAD 测定条件 色谱柱：Diamonsil C18色谱柱（4.6mm×250mm，5μm）；流动相：A为0.1%甲酸-水溶液，B为乙腈，洗脱条件为：0 - 20min、5% →25%B；20 -60min、25% →80%B；60-85min、80%→80%B；85-87min、80%→100%B；87-90、100%→100%B；流速1ml/min；进样量30μL；柱温30℃；DAD 检测器，检测波长254nm。

2.3 样品测定及数据分析

2.3.1 HPLC-DAD 测定及数据分析 取“2.1.1～2.1.4”制备好的雷公藤药材、总生物碱、雷公藤红素及其煨制品溶液，混合对照品溶液，按照“2.2”测定条件进行HPLC-DAD 分析。

3 结果与讨论

3.1 HPLC-DAD 检测结果 雷公藤药材，总生物碱，雷公藤红素生品及其煨制品HPLC-DAD 分析结果见图1。由图1 可见：雷公藤煨制后化学成分含量发生了显著变化，还新产生一些成分。根据对照品对照结合DAD 光谱鉴定的雷公藤煨制前后22 种显著性差异化合物信息见表1，其中确定结构的化合物8 种。由图1 和表1 可见：雷公藤煨制后，南蛇藤肉桂酰胺碱，雷公藤定碱，雷公藤吉碱，雷公藤次碱，去甲泽拉木醛，雷公藤红素等10 种成分含量显著降低；新产生成分12 种，来源于雷公藤红素的煨制产物10 种，为1-羟基-2， 5， 8-三甲基-9-芴酮，25（9 →8），26（13 →14）Abeo-24-nor-8，14-seco-friedelan-2，3-dihydroxy-1，3，5（10），6，8-pentaen-29（13）-olide 等化合物，来源于睛眯类生物碱的煨制产物2 种。HPLC-DAD 分析结果进一步表明，生物碱、去甲泽拉木醛和雷公藤红素的变化可能是雷公藤煨制减毒增效的物质基础。

3.2 HPLC-DAD 紫外图谱 根据HPLC-DAD 测得的22 种成分紫外图谱进行类型和来源鉴定，代表性DAD 紫外图谱见图2。图1 中“1，1’，12’”三种成分的紫外吸收光谱类似，与睛眯类生物碱紫外吸收光谱相似。“5’～11’”紫外吸收光谱类似，再对比雷公藤红素煨制前后HPLC 图谱。可判断其可能均来源于雷公藤红素，且是同一类化合物。“5，6，8”三种成分采用对照品鉴别为倍半萜类生物碱。“2，3，4，7”四种成分紫外图与倍半萜类生物碱相似，可能为倍半萜类生物碱。“2’，4’ ”还不能确定其结构类型，但是它们也来源于雷公藤红素，有待于进一步研究。

图1 HPLC图谱

图2 鉴定的代表性成分DAD紫外图谱

4 结论

本文采用HPLC-DAD 技术对雷公藤生品及其煨制品中的化学成分进行对比分析，发现雷公藤煨制后有22 种化学成分变化显著。结合对照品及文献对这些化合物进行结构解析，共鉴定了8 个化合物的结构，这些化合物大部分是生物碱，其次是三萜，其中南蛇藤肉桂酰胺碱，雷公藤定碱，雷公藤吉碱，雷公藤次碱，去甲泽拉木醛，雷公藤红素等10 种成分含量显著降低。新产生成分12 种，包括来源于雷公藤红素的煨制产物10 种，来源于睛眯类生物碱的煨制产物2 种。生物碱、去甲泽拉木醛和雷公藤红素均为雷公藤抗炎有效成分，用时又是毒性较大的成分［12-14］。因此生物碱、去甲泽拉木醛和雷公藤红素的变化可能是雷公藤煨制减毒增效的物质基础。本研究结果与前期研究结果基本吻合［10-11］，进一步确定了生物碱和雷公藤红素的变化是雷公藤煨制减毒增效的物质基础，也为雷公藤煨制机理研究奠定了坚实基础。