杨延波，谢晓田，张雪静，郑永利，朱利民

(东华大学 a. 化学化工与生物工程学院； b. 东华大学-伦敦都市大学中英药用纺织品联合实验室，上海 201620)

二维过渡金属二硫化物(TMDCs)纳米材料由于其独特的电子特性、高比表面积和高吸光度，引起学者的广泛关注[1]。MoS2纳米片作为TMDCs的典型代表，具有高NIR(近红外，700～1 100 nm)吸光度和低毒性，成为下一代光热转换材料的最佳选择[2]。特别是其组成元素Mo是细胞中几种酶的必需微量元素，S是一种常见的生物元素[3]，因此MoS2是一种可用于生物医学领域的出色材料。然而，由于MoS2的表面能较高，纳米片在数量较多时往往不可避免地重新堆积和聚集，这极大地限制了其应用[3]。此外，目前制备的MoS2纳米片的胶体稳定性不理想[4-7]，而这对于生物医学领域的应用至关重要。因此，基于MoS2的靶向药物递送系统的应用受到限制。

在前期的研究工作中发现，功能化的MoS2纳米片可以将化学疗法和光热疗法相互组合，从而用于靶向药物递送，但协同治疗效果有待加强[8]。黑色素是人体内源性生物色素，具有固有的光学吸收能力，主要存在于皮肤、毛囊和眼睛中，基于黑色素的纳米平台在诊断成像和光热疗法中展现出巨大的前景。Zhang等[9]报道了一种基于黑色素(Mel)的纳米脂质体诊断治疗系统，其具有理想的光热转换效率、治疗性能和生物安全性，可以实现乳腺癌荷瘤小鼠肿瘤的完全根除。基于黑色素的纳米粒子可用作光声成像(PAI)和磁共振成像(MRI)的多功能造影剂，具有理想的生物安全性和较低的副作用。

本文基于单层MoS2纳米片设计了一种纳米复合物，其由聚乙烯亚胺(PEI)连接透明质酸(HA)，同时用聚乙二醇(SH-PEG)修饰MoS2纳米片，最终制成HA-PEI-LA-MoS2-SH-PEG(简称HPMP)纳米载体，其可用于递送并在pH、NIR双重刺激响应下释放化疗药物盐酸阿霉素(DOX)，将DOX和光热剂MoS2、Mel相结合可应用于肿瘤的化疗-光热协同治疗。

1 试验部分

1.1 原材料及试剂

透明质酸(Mw=0.5 kDa)，购自天津希恩思奥普德科技有限公司；黑色素，购自北京科瑞迈科技有限公司；聚乙二醇(SH-PEG，Mw=2 kDa)，购自上海湃阁恩贸易经营部；聚乙烯亚胺、盐酸阿霉素、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，购自阿拉丁生化科技股份有限公司；α-硫辛酸(LA)、己烷中的n-BuLi溶液(2.4 M)，购自阿拉丁生化科技股份有限公司；乙腈，购自上海凌峰化学试剂有限公司；磷酸缓冲盐(PBS)溶液，购自Sigma-Aldrich；其他材料和透析袋均购自国药集团化学试剂有限公司。试验中所用的药品均为分析纯，试验中所用的水均为Milli-Q Plus 185净水系统纯化所得超纯水。

1.2 试验方法

1.2.1 MoS2纳米片的制备[10]

将0.3 g钼酸钠和0.6 g硫代乙酰胺分散在30 mL水中，超声15 min后磁力搅拌至完全溶解。在220 ℃反应釜中反应24 h，反应结束后离心，用去离子水洗涤3次，冷冻干燥收集黑色沉淀物得到MoS2纳米片。

1.2.2 PEI-LA-MoS2-SH-PEG(简称PMP)的制备[11]

将300 mg PEI溶解在超纯水中，用稀盐酸调节溶液的pH至中性，将82.4 mg LA溶解在20 mL乙腈溶液中，之后将191.7 mg EDC和115.1 mg NHS加入到溶解LA的乙腈溶液中，搅拌均匀后，加入到PEI溶液中搅拌过夜，然后将溶液透析、冷冻干燥得到LA-PEI。将30 mg LA-PEI加入到10 mL质量浓度为0.25 mg/mL的MoS2分散液中，超声30 min后搅拌过夜，然后离心，用蒸馏水洗涤沉淀3次，透析、冷冻干燥得到PEI-LA-MoS2(PM)。取3 mL质量浓度为0.5 mg/mL的PEI-LA-MoS2溶液加入15 mg SH-PEG，超声30 min，然后磁力搅拌12 h，制备得到PMP。

1.2.3 HPMP的制备

将30 mg HA溶解于15 mL超纯水，再加入10 mL质量浓度为0.8 mg/mL的EDC溶液，超声15 min，再分别加入10 mL质量浓度为1 mg/mL的EDC溶液、15 mL质量浓度为2 mg/mL且pH=8.5的NHS水溶液。将上述所制溶液在室温下搅拌2 h，后加入15 mg PMP，搅拌过夜，然后离心，冷冻干燥得到HPMP。

1.2.4 HPMP的载药能力和药物释放研究

将HPMP与模型药物DOX按不同比例在pH=7.4的PBS溶液中混合，搅拌过夜。离心收集上层清液，通过紫外分光光度计测试其载药能力。预试验发现，当DOX与HPMP的质量比为1∶1时，载体的载药能力最强，1 g HPMP能负载812.5 mg DOX。

将质量比为1∶1的HPMP与DOX在pH=7.4的PBS溶液中混合，搅拌过夜，离心冻干收集沉淀。称取3 mg载药载体分散在3 mL不同pH值的PBS溶液中，然后置于透析袋(截留相对分子质量为6 000)中透析，透析袋外部为50 mL对应pH值的PBS溶液，每间隔一定的时间取透析袋外部液体1 mL，测溶液在波长480 nm 处的紫外吸收并补充透析袋外部液体使之保持不变。载药效率(η)按式(1)计算。

(1)

1.3 材料表征

使用日本JEOL公司的JEM-2100型透射电子显微镜(TEM)观察制备的MoS2的形貌。使用美国布鲁克海文仪器公司的BI-200 SM型静态光散射仪对MoS2、 HPMP进行水动力学直径(DLS)测试。使用美国Nicolet公司Nexus-670型傅里叶红外光谱仪(FTIR)对PEI-LA-MoS2(简称PM)、PMP、HPMP进行测试分析，波数为600～4 000 cm-1，间隔为2 cm-1。使用英国的马尔文Malvern Zetasizer Nano ZS 90型纳米粒度电位仪对MoS2纳米片、PM、 PMP、 HA和HPMP的Zeta电位变化进行测量。使用UV 3600型紫外可见分光光度计对载药前后的HPMP以及DOX进行测试。

2 结果与讨论

2.1 MoS2及其复合物的表征

2.1.1 TEM及DLS分析

将制备的MoS2纳米片重新分散在水溶液中，超声使其均匀分散，通过TEM观察所制备的MoS2纳米片的形状，如图1所示。从图1中可观察到均匀分散的MoS2片状结构，平均粒径为80 nm。这与DLS测试的MoS2水溶液的水动力学直径一致，这个粒径大小有利于肿瘤细胞通过内吞途径对载药纳米复合物进行摄取[12]。

将SH-PEG修饰在单层MoS2纳米片表面，进一步接枝PEI并用HA修饰以后，纳米复合物的水动力学直径从大约80 nm升高至104 nm左右，这一粒径使得HPMP纳米复合物的静脉注射给药或通过EPR(electron paramangnetic resonance)效应使得药物被动积累在肿瘤部位成为可能[13]。

2.1.2 红外光谱分析

采用压片法对PM、 PMP、 HPMP进行红外光谱分析，结果如图2所示。从图2可以看出，PM红外谱图的2 924 cm-1处有饱和C—H特征峰，这表明PEI分子成功接枝在MoS2纳米片上，1 698 cm-1处有—CONH—特征峰，说明LA与PEI通过酰胺键成功连接。在PMP红外谱图中1 340、 1 096 cm-1处有CH3的对称变形振动峰以及C—O键的伸缩振动峰，说明SH-PEG分子已成功修饰MoS2纳米片。HPMP的红外谱图中3 283 cm-1处的特征峰归因于HA中C—H键的伸缩振动峰。由此可见，材料HPMP已成功制备。

2.1.3 Zeta电位分析

MoS2纳米片、PM、 PMP、 HA和HPMP的Zeta电位变化如图3所示。由图3可知，MoS2纳米片的电势是-24 mV，经LA-PEI修饰后，电势从负值(-24 mV)变为了正值(+6 mV)，说明PM已经成功制备。然后用SH-PEG来修饰所制备的PM以改善纳米复合物的胶体稳定性，电势从正值(+6 mV)进一步变为负值(-14 mV)，说明SH-PEG已成功加载在纳米复合物PM上，从而制成PMP。最后，用靶向分子透明质酸HA来修饰PMP，以使该药物递送系统具有主动靶向肿瘤部位的能力，PMP的电势从-14 mV变为-23 mV，表明靶向分子HA已在其上成功聚合。

2.1.4 稳定性分析

将所制备的无SH-PEG修饰的PM和SH-PEG及HA修饰的HPMP分别配成20 mL水溶液(质量浓度为1 mg/mL)放置在室温下，分别在1、 24 h后观察两种溶液的变化情况，如图4所示。由图4可以看出，放置1 h后，PM和HPMP溶液都没有出现明显的集聚现象，但经过24 h后，无SH-PEG修饰的PM溶液出现明显的集聚现象，而经SH-PEG修饰的HPMP溶液分散均匀，显示出更高的胶体稳定性，可以较好地分散在水中而无任何附聚。

2.2 纳米复合物的光热效果测试

2.2.1 加载黑色素的影响

载药纳米复合物HA-PEI-LA-MoS2-SH-PEG@DOX(简称HPMP@DOX)与黑色素按照5∶1的质量比混合，得到HA-PEI-LA-MoS2-SH-PEG@(DOX/Mel)(简称HPMP@DOX/Mel)，其和无黑色素的载体HPMP@DOX光热效果的对比如图5所示。由图5可知，对于HPMP@DOX，在600 s内其水溶液(质量浓度为1 mg/mL，功率密度为1 W/cm2) 的温度从25 ℃升高至44 ℃，而在相同条件下，加载黑色素的载体HPMP@DOX/Mel的温度从25 ℃升高至56 ℃。由此表明，黑色素的加载显著提高了纳米复合材料的光热效果，使其具有应用于肿瘤细胞化疗-光热治疗协同治疗的潜力。

2.2.2 质量浓度和暴露时间的影响

将不同质量浓度的HPMP@DOX/Mel复合物的悬浮液暴露于808 nm激光(功率密度为1.0 W/cm2)中，并将纯净水作为对照样，试样的光热效果如图6所示。由图6可知，随着质量浓度和暴露时间的增加，HPMP@DOX/Mel水分散体的温度明显升高，表明所制备的纳米复合物的光热效果具有浓度依赖性。当HPMP@DOX/Mel纳米复合材料的质量浓度为0.8 mg/mL时，溶液温度可在300 s内达到52 ℃，从而证实HPMP@DOX/Mel纳米复合材料具有良好的光热效果。

2.2.3 激光照射强度的影响

HPMP@DOX/Mel质量浓度为1.0 mg/mL时，不同激光照射强度下的光热效果如图7所示。由图7可知，相同质量浓度下，激光照射强度越大，温度升高幅度越大。当激光照射功率密度为0.5 W/cm2时，300 s内HPMP@DOX/Mel水溶液的温度从25 ℃升高至35 ℃；而当激光照射功率密度为1.5 W/cm2时，300 s内其水溶液的温度从25 ℃升高至68 ℃。由此表明，所制备的纳米复合物HPMP@DOX/Mel的光热效果具有激光功率依赖性。

2.2.4 NIR激光循环的影响

在NIR激光照射下，4次开、关循环对HPMP@DOX/Mel溶液温度的影响如图8所示，其中，NIR激光照射功率密度为1.0 W/cm2，HPMP@DOX/Mel质量浓度为1.0 mg/mL，体积为1 mL。

由图8可知，经过4次循环后，在温度-时间曲线中未观察到明显的温度衰减，这意味着HPMP@DOX/Mel纳米复合材料具有优异的光热稳定性，适用于肿瘤的光热消融。

2.3 HPMP的载药及体外药物释放研究

2.3.1 紫外光谱分析

对载药前后载体HPMP和DOX的紫外光谱进行分析，结果如图9所示。由图9可知，单独的阿霉素DOX在480 nm处有明显的吸收峰，而载药后的纳米复合物HPMP@DOX的紫外吸收光谱在480 nm处也出现了明显的吸收峰。由此表明，化疗药物阿霉素DOX已成功加载于纳米复合物HPMP上。

2.3.2 药物的体外释放测试

在pH值为7.4的条件下研究了DOX与HPMP药物上载的最佳质量比，结果如表1所示。由表1可知，最大载药效率为81.25%，即当纳米复合材料HPMP与DOX以1∶1的质量比混合时，载药效率达到最大值，在1 g HPMP上可负载约812.5 mg DOX。

表1 与DOX以不同比例混合的HPMP的载药量

在有无NIR激光照射和不同pH值的PBS溶液中，研究体外控制的药物释放随时间的变化，结果如图10所示，其中，NIR激光照射功率密度为1.5 W/cm2，波长为808 nm。

由图10可知，药物释放1 h后，在pH值为7.4、没有NIR激光照射时，从HPMP@DOX中释放的DOX小于5%。然而，在pH值为5.0且没有NIR激光照射时，1 h后DOX的释放超过12%。这可能归因于在弱酸性条件下DOX与纳米复合材料HPMP的相互作用的减少，包括疏水相互作用和静电相互作用，因此可以显著加速DOX的释放。在pH值为5.0且没有NIR激光照射的情况下，6 h内释放约24.8%的DOX。当存在NIR激光照射时，DOX释放得更快，其在pH值为5.0时，6 h内释放量增加至31.6%。由此可见，NIR激光触发的光热效应可以促进DOX的释放，这可能归因于MoS2纳米片产生的高温引起HPMP纳米复合材料的振动，从而减少了DOX与之的相互作用。由于激光照射可以精确调节，因此pH/NIR多刺激响应的HPMP@DOX可以应用于癌症的“按需”化疗。

3 结 语

本文对单层MoS2进行修饰，在MoS2表面接枝了含有巯基的聚乙二醇，以聚乙烯亚胺为连接臂接枝透明质酸，使其获得更好的稳定性、pH和近红外光双重刺激响应性。此外，选用盐酸阿霉素作为模型药物研究了具有双重响应性的HA-PEI-LA-MoS2-SH-PEG的体外药物释放行为，结果显示：这种双重响应性MoS2复合物在模拟肿瘤的弱酸性(pH≈5.0)环境下，拥有显著增加的药物释放速率；在近红外光的激光照射下也表现出更快的释药速率，表明载体具有较好的控释效果。此外，载体表面新型的光热剂黑色素的负载显著提高了纳米复合材料的光热效果，表明其有应用于生物医学领域以进行化疗光热协同治疗的潜在价值。