吴彪 贺奕森 付文博 郝光飞河北工程大学生命科学与食品工程学院 河北 邯郸 056000

多不饱和脂肪酸，特别是ARA对人类的营养与健康有重要的作用，现已应用于食药、饲料及化妆品等行业，并具有广阔的市场前景[1]。ARA的传统来源是从动植物中提取，由于提取成本高和提取量少的特点使得其已无法满足市场的需求[2]。因此研究人员开始致力于将微生物作为ARA来源的研究，特别是具有高产ARA能力的高山被孢霉得到了广泛关注。

高山被孢霉生产的ARA通过了FDA 安全性评估并已进行工业化生产，但其ARA的含量受发酵培养基中碳源、氮源及无机盐等组分的种类和添加量的影响较大。碳源可为菌体的生长增殖以及代谢产物的积累提供必需的碳成分和能量[3]，氮源则主要用于构建菌体的含氮代谢物[4]，无机盐是维持菌体内酸碱平衡和渗透平衡的关键因素[5]，因此在发酵培养基中选择合适的碳源、氮源、无机盐的种类和添加量对提高高山被孢霉中ARA含量尤为重要。

目前存在较多高山被孢霉产ARA发酵培养基的组成方案及优化方法，但在ARA含量和资源综合利用等方面还需进一步完善。本文以高山被孢霉BD-19为研究菌株，在前期单因素试验的基础上，设计响应面试验确定主要因素的最佳浓度组合，从而完成对高山被孢霉BD-19发酵培养基的优化。

1 研究方法

1.1 Plackett-Burman试验

在单因素试验的基础上，以ARA含量作为响应值，设计Plackett-Burman试验从六个因素中筛选出四个影响ARA含量显著的因素。其中Plackett-Burman试验中每个因素取低( -1)和高( 1) 两个水平，试验因素和水平取值具体为：A 葡萄糖（60、120 g/L）、B 酵母提取物（10、20 g/L）、C KH2PO4（2、4 g/L）、D NaNO3（2、4 g/L）、E MgSO4（2、4 g/L）、F CaCl2（2、4 g/L）。

1.2 最陡爬坡试验

在Plackett-Burman试验结果的基础上，根据ARA含量变化梯度方向确定的爬坡方向和各因素效应值大小确定的变化步长，设计最陡爬坡试验以确定响应面优化试验中心点。

1.3 Box-Behnken响应面试验

在Plackett-Burman试验与最陡爬坡试验的基础上，设计Box-Behnken响应面试验以确定最佳的浓度组合。其中Box-Behnken响应面试验中每个因素取低( -1) 、中（0）、高( 1)三个水平，试验因素和水平取值具体为：A 葡萄糖（50、60、70 g/L）、B 酵母提取物（7.5、9、10.5 g/L）、C KH2PO4（2.5、3、3.5 g/L）、D NaNO3（2.5、3、3.5 g/L）。

1.4 数据统计分析

本试验利用Design Expert 8.0.6软件对Plackett-Burman试验和Box-Behnken响应面试验进行相应的设计及有关数据的处理。

2 结果与分析

2.1 Plackett-Burman试验结果与分析

Plackett-Burman试验设计与结果见表1。通过分析Plackett-Burman试验结果后得到回归方程：Y=5.973+0.549A-0.469B-0.316C+0.296D-0.078E-0.071F。并 由 此 可 知 各 因 素对ARA含量影响程度由大到小的排列顺序为：A＞B＞C ＞D ＞E＞F。并且葡萄糖和酵母提取物对ARA含量影响达到极其显著水平，KH2PO4和NaNO3达到显著水平，而MgSO4和CaCl2影响不显著。因此选择显著性相对较大的葡萄糖、酵母提取物、KH2PO4和NaNO3四个因素进行最陡爬坡试验设计。

表1 Plackett-Burman试验设计与结果Table 1 The design and results of the Plackett-Burman design

2.2 最陡爬坡试验结果与分析

通过分析最陡爬坡试验结果可知：随着葡萄糖和KH2PO4浓度增加、酵母提取物和NaNO3浓度减小，ARA 含量先增加后减小。其中培养基组分为葡萄糖60 g/L，酵母提取物9 g/L，KH2PO4 3 g/L，NaNO3 3 g/L时，ARA含量达到最大值，即此时培养基条件可作为Box-Behnken响应面试验的中心点。

2.3 Box-Behnken响应面试验结果

Box-Behnken试验设计与其结果见表2。通过分析Box-Behnken响应面试验结果后得到拟合回归方程：Y=7.592+1.170A+0.585B+0.300C+0.290D+0.228A★B+0.218A★C-0.070A★D+0.025B★C-0.183B★D+0.003C★D-0.860A2-1.593B2-0.310C2-0.788D2。并且在该试验中P＜0.0001、CV=7.62 %、Adeq Precision=13.412和失拟项为0.0995＞0.05，表明该模型线性关系显著，失拟项差异不显著且精密度良好，可用于高山被孢霉BD-19的ARA含量的预测。

表2 Box-Behnken试验设计与结果Table 2 The design and results of the Box-Behnken design

2.4 响应面试验分析

通过分析各因素浓度及其相互作用对ARA含量影响的三维曲面图（如图1）可知，响应面分析图均开口向下，说明回归方程存在最大值，即存在最大的ARA含量。以ARA含量为响应值，通过Design Expert 8.0.6软件分析得到最佳浓度组合：葡萄糖 68.05 g/L，酵母提取物9.36 g/L，KH2PO4 3.39 g/L和NaNO3 3.06 g/L，并且此条件下理论上ARA含量可达到最大值8.27 g/L。

2.5 响应面最优条件验证

根据上述最佳浓度组合，对高山被孢霉BD-19进行多批次实验验证，经摇瓶发酵7天后其ARA平均含量为8.25 g/L，与预测值( 8.27 g/L)的相对误差为0.24%。此结果表明没有显著性差异，优化模型稳定可靠。

3 结论

本研究基于响应面分析法确定了高山被孢霉BD-19产ARA发酵培养基中四个主要因素的最佳浓度组合：葡萄糖68.05 g/L，酵母提取物9.36 g/L，KH2PO4 3.39 g/L和NaNO3 3.06 g/L。同时通过多批次实验验证，ARA的平均含量为8.25 g/L，与预测值( 8.27 g/L)的相对误差为0.24%，同时与优化前的初始发酵培养基相比，ARA含量提高了16.20%，为高山被孢霉BD-19工业化生产ARA提供了研究基础。