赵一波 邢 述

肺癌无论是发病率还是死亡率均高居全世界恶性肿瘤之首。虽然当今肺癌治疗手段有很大发展，但其预后仍然较差。以铂类为主的联合化疗方案仍然是目前肺癌治疗的重要手段，常规化疗虽然取得了较大的进步，但是大剂量、多疗程、多联合化疗会加剧患者毒副作用、严重抑制免疫系统，使得机体的免疫力下降，严重损伤患者的机体。同时化疗药物产生的耐药性成为肺癌治疗的难点[1]。肺癌的发病是1个多因素、多阶段、多基因及多信号通路共同作用的复杂机制，Wnt/β-catenin信号通路的异常激活在肺癌的发生、发展中也起着重要作用[2]。近年来COX-2抑制剂的抗肿瘤作用日益受到人们的关注，其可以通过多种途径对肿瘤生长产生抑制作用[3]。因此，本研究拟以肺腺癌A549细胞系为研究对象，研究探讨COX-2抑制剂(塞来昔布)联合顺铂对肺腺癌细胞增殖和凋亡的影响，以及与Wnt/β-catenin信号通路之间的关系，为两药联合应用临床治疗肺癌提供实验和理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要药品和试剂

人肺腺癌A549细胞株购于中科院上海细胞库，塞来昔布胶囊(西乐葆)(0.2g，辉瑞制药有限公司，批准文号：国药准字J20180063)，注射用顺铂(冻干型)(10mg，齐鲁制药有限公司，批准文号：国药准字H20183652)；RT-PCR试剂盒购于日本TaKaRa公司，MTT试剂盒购于美国Sigma公司；兔抗人Wnt、β-Catenin和c-myc单克隆抗体均购于美国Abcam公司，GAPDH单克隆抗体、FITC标记羊抗兔IgG购于武汉博士德生物工程有限公司；Hoechst3358试剂染液购于北京百奥莱博科技有限公司，TUNEL试剂盒购于美国罗氏公司，ABI Prism7500型荧光定量PCR仪购于美国应用生物系统公司，流式细胞仪购于美国CST公司。

1.2 方法

1.2.1 人肺腺癌A549细胞培养 肺腺癌A549细胞株培养于含10%胎牛血清、青链霉素(青链霉100 U/ml，链霉素100 μg/ml)的RPMI-1640培养基，于37 ℃、95%饱和湿度，5% CO2培养箱，每2 d更换一次培养基，实验均取处于对数生长期的细胞，制备成单细胞悬液。

1.2.2 细胞药物处理及分组 塞来昔布去除糖衣后溶解于DMSO制成浓度为0.1 mmol/l母液，实验用PBS溶液稀释至目标浓度，保持终溶液DMSO浓度<0.1%。取对数生长期肺腺癌A549细胞5×105/ml接种于6孔板，培养24 h后吸出孔内培养液，加入相应药物，实验分组：对照组(不加任何药物)；塞来昔布组(塞来昔布；25 μmol/l)；顺铂组：(顺铂；1 mg/l)；联合组：(塞来昔布；25 μmol/l+顺铂；1 mg/l)，均以RPMI 1640培养液配置浓度。

1.2.3 甲基偶氮哇盐法(MTT)检测细胞细胞活力检测 取对数生长期细胞制成单细胞悬液，每孔按100 μl(1×104/孔)接种于96孔培养板中培养，24 h后分别加入不同处理药物及全培养液的空白对照组，置常规培养箱中培养48h后，分别培养0 h、24 h、48 h、72 h时间后每孔加入MTT溶液20 μl(50 mg/ml)，37 ℃孵育4 h；去除上清液，每孔加150 μlDMSO，酶标仪检测每孔波长490 nm吸光度值(A值)，求其平均值，并计算细胞抑制率，抑制率(E)=(1-实验组平均A值/对照组平均A值)×100%，并绘制细胞生长抑制曲线。

1.2.4 流式细胞术检测细胞周期的变化 接种A549细胞24 h后分别加药，48 h后收集细胞，PBS洗2次，参照检测试剂盒说明书逐步操作，最后流式细胞仪上机检测，采用软件分析细胞周期分布变化。

1.2.5 Hoechst3358染色法检测细胞凋亡率 接种A549细胞24 h后加药，48 h后收集不同处理组细胞，4%多聚甲醛固定20 min，添加10 μg/ml Hoechst3358的染液，37 ℃孵育30 min，荧光显微镜观察随机选择至少10个观察视野，计算细胞凋亡率(%)=凋亡阳性细胞数/细胞总数。

1.2.6 免疫荧光法检测细胞Wnt、β-Catenin蛋白的表达 以5×105/ml细胞接种盖片上，24 h后分组处理，孵育48 h后，取出细胞爬片，预温PBS洗涤，4%预冷多聚甲醛固定20 min，PBS洗涤；0.2% Triton X-100通透10 min，PBS洗涤；山羊血清封闭30min，PBS洗涤；添加Wnt和β-Catenin一抗(1∶200)，4 ℃湿盒过夜，PBS洗涤；FITC标记二抗(1∶200)，37 ℃避光孵育1.5 h，PBS洗涤；甘油封片，荧光显微镜采片。

1.2.7 Real-Time PCR方法检测Wnt、β-Catenin和c-myc的mRNA水平 参照Trizol试剂说明书操作提取总RNA，-80 ℃保存备用，鉴定总RNA浓度及纯度。采用Real-Time PCR试剂盒，按照上面反应体系进行cDNA的合成逆转录反应体系。基因引物序列：GAPDH：上游5'-CAGAGTGGACGGATTTTGGTCCTAT-3'，下游：5'-ATCCTTCTCAATCGTGGTGATGTC-3'；Wnt：上游：5'-CAGTGAGCTGGTTGTCACCT-3'，下游：5'-CTGAGCTGCTCCTTGAAGTG-3'；β-Catenin上游：5'-CAAGGAGCAGGTAATCGCAAGT-3'，下游5'-GGAACCAGAATGGGAGAAACG-3'；c-myc：上游：5'-TGAGGAAACGAC GAGAACAG-3'，下游：5'-ACGAGAGATTCCAGCTCCCTTGATTCAAACGC-3'。ABI Prism7500型荧光定量PCR仪中扩增，反应条件：95 ℃预变性2 min，95 ℃变性15 s，60 ℃退火2 min，40个循环。以内参GAPDH进行标准化，采用2-△△Ct法计算基因的相对表达量。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 细胞增殖能力

塞来昔布组、顺铂组、联合组较对照组细胞抑制率增高，细胞增殖能力下降(P<0.05)，尤以联合组细胞抑制率最高，细胞增殖能力最低(P<0.05)；且各组对细胞的杀伤效应呈时间依赖性，见图1。

图1 MTT检测各组细胞增殖生长状况

2.2 细胞周期变化

塞来昔布组、顺铂组、联合组较对照组处于G0/G1期细胞增多(P<0.05)，以联合组处于G0/G1期细胞最多(P<0.05)；塞来昔布组、顺铂组S期、G2期细胞减少(P<0.05)，以联合组处于S期、G2期细胞最少(P<0.05)，见表1。

表1 流式细胞仪检测细胞周期变化

注：※为与对照组比较，P<0.05。

2.3 细胞凋亡率

对照组细胞较多，无边聚，胞质染色均匀一致，荧光较弱；联合组细胞较少形态饱满，形状规则，染色较深、染色质浓集、荧光强，细胞核呈现核固缩浓染，核分叶呈月牙状或蚕豆状，碎裂呈米粒状大小不等的碎片，形成凋亡小体。对照组、塞来昔布组、顺铂组、联合组凋亡率分别为：(0.78±0.04)%、(32.56±1.67)%、(25.67±1.98)%、(63.37±2.12)%。塞来昔布组、顺铂组、联合组较对照组细胞凋亡率增高(P<0.05)，尤以联合组细胞凋亡率最高(P<0.05)。

2.4 Wnt、β-Catenin和c-myc的蛋白表达

Wnt主要表达于A549细胞胞膜和胞质，β-Catenin主要表达于A549细胞胞质，c-myc主要表达于A549细胞胞质。对照组细胞Wnt、β-Catenin和c-myc荧光很强，塞来昔布组和顺铂组荧光强度减弱，联合组荧光强度显著减弱。塞来昔布组、顺铂组、联合组较对照组细胞Wnt、β-Catenin和c-myc的蛋白均降低(P<0.05)，以联合组降低最显著(P<0.05)，见表2。

2.5 Wnt、β-Catenin和c-myc的mRNA表达

塞来昔布组、顺铂组、联合用药组较对照组细胞Wnt、β-Catenin和c-myc的mRNA表达均降低(P<0.05)，其中以联合组降低最显著(P<0.05)，见表3。

3 讨论

非小细胞肺癌(NSCLC)约占肺癌总数的80%。含铂化疗方案是目前NSCLC一线标准化疗方案[4]。而目前化疗药物由于缺乏特异性，毒性反应成为使用剂量受到限制的关键因素，且化疗过程中耐药现象，同时也使患者的依从性和耐受性降低，影响远期疗效和患者的生存质量。环加氧酶(cyclo-oxygenase，COX-2)过度表达与肿瘤的发生、发展密切相关，COX-2促进合成大量前列腺素，提高肿瘤的免疫耐受，降低宿主抗恶性肿瘤免疫监视，导致肿瘤细胞增殖[5]。COX-2抑制剂可抑制其催化产物前列腺素E2的合成，促进干扰素γ及TNF-α产生而恢复和维持免疫平衡，提升免疫监视功能，增加细胞杀伤能力，抑制肿瘤生长，发挥增强免疫的机制[6]。选择性COX-2抑制剂塞来昔布已经证实其对多种肿瘤细胞有很好的抑制作用，化疗药物联合选择性COX-2抑制剂可降低单纯化疗药物所引起的不良反应，具有协同化疗药物通过调节细胞因子，增强机体细胞免疫，杀伤抑制癌细胞生长，从而增强化疗药物敏感性及疗效，还可以减轻化疗药物的毒性，克服化疗药物的耐药性问题[7]。

Wnt/β-catenin信号通路在肺癌发病中发挥了非常重要的作用，其依赖于β-catenin表达调控，参与多种肿瘤的发生、发展的相关作用机制，涉及肿瘤细胞信号传导、细胞周期、细胞增殖、凋亡以及细胞黏附、浸润、转移等一系列过程[8]。Wnt信号异常活化，转导细胞内的信号，Wnt配体与其受体结合，β-catenin被活化，在胞浆异常大量聚集，并进入胞核，并与Axin-APC-GSK-3β形成复合物，与核内转录因子T细胞因子(TCF)/淋巴结增强因子(LEF)相结合，激活下游cyclinD1、Survivin、c-myc等细胞周期相关靶基因的转录，导致肿瘤细胞异常增殖、浸润和转移[9-10]COX-2抑制剂通过药抑制肿瘤细胞胞质内β-catenin向核内转移，减少Wnt/β-catenin信号通路下游靶基因异常表达，从而抑制肺癌的发展[11]。

表2 免疫荧光检测A549细胞Wnt、β-Catenin和c-myc的表达

注：※为与对照组比较，P<0.05。

表3 RT-PCR法检测A549细胞Wnt、β-Catenin和c-myc的mRNA表达

注：※为与对照组比较，P<0.05。

本研究表明，COX-2抑制剂(塞来昔布)和顺铂单独及联合应用均能抑制肺癌细胞增殖，促进癌细胞凋亡，降低Wnt、β-Catenin和c-myc蛋白表达，下调Wnt、β-Catenin和c-myc的mRNA表达，且两药联合效应优于各自单独用药，表明两药联合应用可以共同抑制COX-2-Wnt/β-catenin信号通路，进而抑制其下游靶基因c-myc水平表达。因此，Wnt/β-catenin信号通路的活化状态的变化必然会引起其下游靶基因c-my水平的变化。王玲婵等[12]研究表明艾瑞昔布联合洛铂能够抑制非小细胞肺癌侵袭和转移，艾瑞昔布对洛铂化疗可能具有增敏作用。熊建萍等[13]研究发现COX-2抑制剂塞来昔布联合顺铂可增强对A549人肺腺癌细胞的生长抑制效应。陈刚等[14]研究表明塞来昔布可抑制人肺癌裸鼠移植瘤的生长和血管生成。塞来昔布与奥沙利铂联合应用提高了奥沙利铂的抗肿瘤效果。

综上所述，塞来昔布联合顺铂可协同抑制肺癌细胞生长增殖，促进细胞凋亡，发挥协同抗肿瘤作用，其作用机制可能为两药通过共同抑制Wnt/β-Catenin信号通路，进而发挥协同抗肿瘤的效应。为临床上两药联合应用治疗肿瘤患者提供一定的实验及理论基础。随着本研究的不断深入，Wnt/β-catenin信号通路调控肺癌的关系网络将更加清晰，将更加全面揭示COX-2抑制剂抑制肿瘤，联合化疗药增效的作用机制，为塞来昔布治疗肺癌提供新的实验依据。同时，塞来昔布的最佳剂量、毒副反应等也尚有待于动物实验以及临床实验进一步研究证实。