孙愉洪，王铭正，肖炜，张胜利，张毅

（1.中国农业大学动物科技学院，北京 100193；2.北京市畜牧总站，北京 100107）

在过去几十年里，奶牛经高强度选育，产奶性能持续提升，但与此同时，群体近交程度不断增加，隐性有害基因快速扩散风险增大[1]。HH5是新近发现的一种荷斯坦牛隐性遗传缺陷基因，美国农业部最早通过全基因组标记分析，将其定位于牛9号染色体[2]，后续深入研究揭示致病机理为9号染色体上长达138kb的DNA片段缺失，导致二甲基腺苷转移酶1（TFB1M）基因丢失[3]。突变型纯合个体因缺少TFB1M基因导致核糖体功能障碍，最终造成该基因型的胚胎在妊娠60d左右死亡。HH5基因的共同祖先为1957年出生的加拿大著名公牛Thornlea Texal Supreme[3,4]，其基因在世界范围内广泛扩散，奶业发达国家已将HH5列为常规检测的遗传位点。

目前，HH5遗传缺陷基因的检测方法较为繁琐或成本较高，如基于高分辨率溶解曲线的检测方法[3]虽然可以准确分型，但需要专门仪器和试剂盒，检测成本很高。此外，有国外商业公司（如Neogen）也提供HH5检测服务，但检测周期较长。本研究通过测序发现HH5等位基因包含一段特异性序列，在此基础上建立一种快速、简便的筛查HH5遗传缺陷基因携带者的新方法，并对北京郊区一个荷斯坦牛群进行了检测。

表1 HH5突变型和野生型等位基因Sanger测序引物信息

1 材料与方法

1.1 HH5突变型和野生型等位基因Sanger测序

1.1.1 样本及DNA提取

利用中国农业大学荷斯坦牛基因组信息数据库，依据经单倍型推断[2]的HH5基因型信息，挑选53头荷斯坦公牛，其中野生型纯合子46头，HH5携带者7头。基因组DNA提取自公牛冻精，采用高盐法[5]。

1.1.2 引物设计及PCR条件

基于已知的HH5遗传缺陷基因突变（138kb缺失）所在牛参考基因组（Bos taurus genome assembly UMD3.1）上的位置（BTA9：93.23～93.37Mb）[3]，提取该缺失片段前后两个断裂位点附近的参考基因组序列，设计特异性引物（表1）。

PCR反应体系：总体积25μL，其中10×Buffer 2.5μL ，dNTP混合物（各2.5mmol/L）2μL，Taq酶（5U/μL）0.5μL，上下游引物（20μmol/L）各0.5μL，基因组DNA模板1μL（50ng），ddH2O补至25μ L。

PCR反应条件：94℃预变性5min；然后35个循环，94℃变性30s，60℃或55℃（表1）复性30s，72℃延伸30s；最后72℃延伸7min。

1.1.3 PCR产物Sanger测序

Wild-head引物组合的PCR产物，利用下游引物HH5-1Rnew进行测序；Wild-end引物组合的PCR产物，利用上游引物HH5-2F进行测序；Mutant引物组合的PCR产物，利用内部引物HH5mutF（5’-AAAATACTGG TTTGTTTTGC-3’）进行测序。

1.2 荷斯坦牛HH5遗传缺陷基因检测方法

本研究设计采用等位基因特异性PCR对HH5进行分型，优化双重PCR条件，在一个PCR体系中同时扩增野生型等位基因和突变型等位基因。

1.2.1 样本

从上述测序样本中选取野生型和HH5携带者各2头。

1.2.2 引物设计

通过Oligo6引物设计软件（https://www.oligo.net/），基于上述测序获得的野生型等位基因和突变型等位基因部分序列，结合参考基因组序列，设计等位基因特异性引物（图1），引物序列及PCR产物长度见表2。

HH5-2F与HH5-2Rshort引物组合用于特异性扩增野生型等位基因，HH5-1F与HH5-1mutRnew引物组合用于特异性扩增突变型等位基因。

图1 HH5突变型和野生型等位基因特异性PCR分型引物位置示意图

表2 HH5突变型和野生型等位基因特异性PCR分型引物信息

1.2.3 PCR反应体系

反应体系：总体积25μL，其中金牌Mix快速PCR预混液（内含缓冲液、dNTP、Taq酶）（北京擎科新业生物技术有限公司）22μL，4条引物（浓度均为10μmol/L）各0.5μL，基因组DNA模板1μL（约50ng）。

反应条件：94℃预变性5min；然后35个循环，94℃变性30s，56℃复性30s，72℃延伸30s；最后72℃延伸7min。

1.2.4 PCR产物凝胶电泳检测

制作浓度为2%的琼脂糖凝胶，取PCR产物4μL点样，在TAE缓冲液中110V电压下电泳20min。

1.3 HH5携带率分析

从北京延庆某奶牛场，随机采集372头荷斯坦母牛血液样本，采用天根DP318试剂盒（天根生化科技(北京)有限公司）提取基因组DNA。通过本研究建立的等位基因特异性PCR分型方法检测HH5基因型。

2 结果与分析

2.1 HH5野生型及突变型等位基因序列

将Sanger测序获得的野生型等位基因的部分序列与牛参考基因组（Bos taurus genome assembly UMD3.1）比对，确认序列一致。比较突变型等位基因序列与野生型等位基因序列，发现突变型等位基因可以分为三部分，最前面部分（AACCATTCAA）对应于野生型等位基因序列的前端，最后面部分（TTACA ATGAT）对应于野生型等位基因序列的尾端，中间部分为1个9bp序列（TGATTACAA）（图2）。

Wild type (left)为138kb缺失片段前端（3'端）断裂位点附近的野生型等位基因序列，Wild type (right)为138kb缺失片段后端（5'端）断裂位点附近的野生型等位基因序列，Mutant type为突变型等位基因序列。

图2 HH5野生型及突变型等位基因Sanger测序结果示意图

2.2 HH5等位基因特异性PCR产物的电泳结果

HH5等位基因特异性PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，电泳图显示扩增产物符合预期，野生型纯合子仅出现一条209bp条带，而携带者出现209bp和347bp两种条带（图3），表明本研究设计的2对引物组合可以用于准确鉴别荷斯坦牛是否携带HH5遗传缺陷基因。

通过观察电泳图（图3）发现，在目的条带下方，各泳道都存在明显的引物二聚体条带，但不影响对基因型的判断。

图3 HH5等位基因特异性PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果

2.3 荷斯坦母牛群HH5携带率分析

在372头荷斯坦母牛中，检出12头HH5携带者，携带率为3.23%。为了验证分型结果准确性，本研究对所有12头携带者和5头随机挑选的非携带者进行Sanger测序，结果与PCR分型的结果完全一致，证明本研究建立的等位基因特异性PCR分型方法的可靠性。

3 讨论

过去20多年的时间里，在荷斯坦牛中已先后报道了多种遗传缺陷基因，包括白细胞黏附缺陷（BLAD）[6]、脊柱畸形综合征（CVM）[7,8]和短脊柱畸形综合征（Brachyspina）[9]等。近年来，随着奶牛全基因组标记数据的积累，多种新的有害基因被鉴定出来，例如HH1～HH5[10～12]。HH5是当前荷斯坦牛中一种常见的遗传缺陷基因，在美国和德国牛群中频率分别达到2.22%[12]和2.76%[13]。本研究在北京郊区372头荷斯坦母牛中，检出12头HH5携带者，携带率为3.23%。尽管本研究样本量较小，但显示HH5已经存在于我国牛群中，奶牛场需要关注其负面影响。

HH5缺陷基因的分子机理为9号染色体上138kb大片段缺失，造成二甲基腺苷转移酶1（TFB1M）基因丢失[3]，本研究通过Sanger测序验证了突变型与野生型的序列差异，并发现突变型除了缺失138kb大片段之外，还发生了1个9bp序列（TGATTACAA）的插入（图2）。TFB1M基因对于线粒体中启动蛋白翻译至关重要，其主要功能是使位于线粒体12S rRNA 3'端发夹环的腺嘌呤残留发生二甲基化，此过程对核糖体小亚基的合成和生物功能起决定性作用[14]。HH5呈常染色体隐性遗传，缺陷型等位基因携带者表现正常，但若携带者公牛与携带者母牛之间交配，1/4后代为隐性纯合子，可导致胚胎发育早期死亡。德国学者研究显示，HH5缺陷基因纯合子胚胎在发育56～90d之间死亡，风险交配（母牛的父亲及母牛的与配公牛均为携带者）较非风险交配（均为非携带者）可导致青年牛和成母牛56d非返情率分别下降5.4%和8.9%[13]。以母牛一次流产的经济损失200美元[12]测算，遗传缺陷为奶牛繁殖带来的负面效应相当可观，因此亟需采取科学选配方法，避免因风险交配导致的有害基因纯合。

采用有效手段筛查有害基因携带者是科学选配的前提。本研究针对突变型和野生型等位基因的序列差异，建立了一种基于等位基因特异性PCR检测方法，通过常规PCR反应及琼脂糖凝胶电泳即可准确分型（图3）。与已报道的高分辨率溶解曲线的检测方法[3]相比，具有简便、易操作、低成本的优点。此外，本研究通过引物设计优化，实现两对引物在同一个反应体系中完成，大幅提高了检测效率，为在我国奶牛场开展针对HH5缺陷基因的科学选种和选配提供了技术手段。