张卫华，陈 东

骨质疏松是一种全身性骨骼疾病，以骨量低、骨组织微结构损坏、骨脆性增加、易骨折等为病理特征，多发于脊椎、髋部及腕部等。骨质疏松骨折虽不直接致死，但骨折后患者长期卧床容易产生一系列并发症，严重影响老年人生活质量，甚至危及患者生命[1]。体外冲击波(extracorporeal shock wave，ESW)是一种带有能量的生物学刺激，具有成骨作用。富血小板血浆(platelet rich plasma，PRP)中含有大量的生长因子，可促进成骨细胞的增殖与活化、血管与骨再生，有助于骨缺损的修复。据报道[2-3]，ESW、PRP对骨质疏松骨折大鼠骨愈合有一定促进作用，但关于二者联合在骨质疏松骨折大鼠中的研究较少。现通过建立骨质疏松骨折大鼠模型，分析ESW联合PRP对大鼠模型骨愈合的影响，并初步探究其作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物50只雌性SD大鼠，体质量200～220 g，3月龄，购自广州弗尔博生物科技有限公司，动物许可证号：SCXN(粤)2018-0136，SPF级动物房中适应性喂养3 d后用于后续实验。

1.2 试剂与仪器克氏针(上海易汇生物科技有限公司)；ELISA试剂盒(美国Thermo公司)；蛋白一抗(美国Cell Signaling公司)；骨密度仪(美国Faxitron公司)；C型臂X光片机(德国SIMENS公司)；显微镜(德国Eppendrof公司)；冲击波治疗仪(意大利PAGANI公司)。

1.3 模型构建

1.3.1骨质疏松模型 采用双侧卵巢摘除术(ovariosteresis，OVX)构建骨质疏松大鼠模型[4]，腹腔注射戊巴比妥麻醉大鼠，腹部去毛备皮，消毒后开腹，小心剥离肌层，暴露卵巢(呈淡红色、卵圆形，表面有不规则结节状卵泡，周围有白色脂肪系带)切除整个卵巢组织，依次缝合、关腹。对照组(Control)切除等量卵巢周围脂肪组织替代；3个月后采用骨密度仪检测大鼠右侧股骨骨密度，验证骨质疏松模型是否构建成功。术后注意保暖和抗菌(腹腔注射5万单位青霉素钠盐，连续注射3 d)，各组大鼠分笼饲养，自由摄食饮水。

1.3.2骨质疏松骨折模型 骨质疏松大鼠模型构建3个月后，参照文献[5]制备骨质疏松骨折模型。麻醉大鼠，于右侧膝关节内侧和股骨远端外侧作切口，暴露膝关节，钝性分离髌骨，暴露股骨髁间窝；于股骨中远端外侧作1.0 cm～1.5 cm切口，逐层分离，暴露股骨中远端，使用钢锯横向切断，造成骨折；植入克氏针(直径1.5 mm)，从股骨远端髁间窝穿出，再反向插入股骨近端，最后于股骨髁间窝处剪短克氏针。术后注意保暖和抗菌(腹腔注射8万单位青霉素钠盐，连续注射3 d)，各组大鼠分笼饲养，自由摄食饮水。

1.4 分组与干预将50只雌性SD大鼠随机均分为Control组、OVX组、OVX+ESW组、OVX+PRP组和OVX+ESW+PRP组，造模过程中均未出现感染和死亡。除Control组外，其他组采用OVX法构建骨质疏松大鼠模型，Control组切除等量卵巢周围组织；上述组别大鼠均造成右侧股骨骨折，并用克氏针髓内固定，骨质疏松骨折模型构建1周内，OVX+ESW组大鼠骨折处予以ESW治疗，OVX+PRP组予以PRP治疗，OVX+ESW+PRP组予以ESW联合PRP治疗；冲击波参数：能流密度0.28 mJ/mm2，频率5 Hz，2 000脉冲/只，1次/周，共治疗8周。PRP的制备：各组大鼠术前眼眶取血0.3 ml，仅OVX+PRP组和OVX+ESW+PRP组大鼠骨折处注入PRP凝胶(PRP ∶ 凝血酶体积比=10 ∶ 1)。

1.5 观察指标

1.5.1影像学观察 骨质疏松骨折模型构建后、治疗8周时，麻醉大鼠，取俯卧位，采用C型臂X光片机观察骨折处对位对线、加锁髓内针位置及骨痂生成情况，分析股骨骨折处愈合情况，以上阅片过程由2名不参与手术过程骨科医师独立进行，并共同商议出最终结果。

1.5.2组织学观察 干预结束后，采用断颈法处死大鼠，取出右侧股骨骨折处骨痂组织，固定于10%的甲醛中，经20% 乙二胺四乙酸(ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA)脱钙处理后，行常规石蜡包埋切片(厚度0.5 cm)，HE染色后显微镜下观察组织学变化。

1.5.3生物力学观察 干预结束后，采用断颈法处死大鼠，取出骨折股骨，并剔除周围软骨组织和髓内针，行三点弯曲试验，检测骨折股骨最大载荷。

1.5.4血清骨生化指标的检测 干预结束后，麻醉大鼠，立即心脏取血，以3 000 r/min离心10 min，分离上清液，参照ELISA试剂盒说明书步骤进行操作，检测大鼠血清骨碱性磷酸酶(bone alkaline phosphatase，BALP)、骨钙素(bone gla protein，BGP)及Ⅰ型前胶原羧基端肽(procollagen typeⅠcarboxy-terminal peptide，PICP)的含量。

1.5.5BMP-2通路蛋白的检测 干预结束后，采用断颈法处死大鼠，取出右侧股骨骨折处骨痂组织，参照蛋白提取试剂盒说明书提取骨架组织中的总蛋白，检测蛋白浓度后，取50 μg进行SDS-PAGE凝胶电泳，待溴酚蓝电泳至底部时，将蛋白条带电转至PVDF膜，浸没于5%脱脂奶粉中封闭2 h，4 ℃孵育相应蛋白一抗过夜，包括β-Actin(1 ∶ 1 000)、骨形态发生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2，BPM-2)(1 ∶ 1 500)、成骨分化关键转录调控因子2(runt-related transcription factor 2，RUNX2)(1 ∶ 1 500)及锌指结构转录因子(osterix，OSX)(1 ∶ 1 000)；分别浸没于辣根过氧化物酶标记山羊抗兔、抗鼠蛋白抗体(稀释比均为1 ∶ 8 000)中孵育1 h，滴加ECL发光液显影，采用Image J软件扫描蛋白条带，以β-Actin为内参，计算BPM-2、RUNX2及OSX的相对蛋白表达量。

2 结果

2.1 骨质疏松大鼠骨密度的变化行OVX术3个月后，Control组大鼠骨密度为(0.29±0.05)g/cm2，行OVX术大鼠的骨密度为(0.22±0.07)g/cm2，显著低于Control组(t=2.813，P=0.009)。

2.2 ESW联合PRP对骨质疏松骨折大鼠影像学的影响如图1，右侧股骨骨折术后X线检查显示，术后各组大鼠骨折固定情况良好；治疗8周后，Control组骨折线基本消失，并有连续的骨痂组织通过骨折断端；OVX组骨折清晰，骨折断端为纤维性软骨痂；OVX+ESW+PRP组骨折线模糊，有大量骨痂组织形成，骨折愈合程度优于OVX+ESW组、OVX+PRP组。

2.3 ESW联合PRP对骨质疏松骨折大鼠骨痂组织病理学的影响如图2，HE染色显示，治疗8周后，Control组有大量成熟的骨小梁形成，且粗大、排列整齐；OVX组软骨痂周围部分软骨组织出现坏死，原始骨小梁间隙为结缔组织；与OVX组相比，OVX+ESW+PRP组骨小梁变粗、数量增多，排列比较有序，组织病理改善效果优于OVX+ESW组、OVX+PRP组。

2.4 ESW联合PRP对骨质疏松骨折大鼠生物力学的影响治疗8周后，与Control组相比，OVX组大鼠骨折处最大负荷降低(P<0.05)；与OVX组相比，OVX+ESW+PRP组最大负荷升高(P<0.05)，且分别高于OVX+ESW组、OVX+PRP组(P<0.05)。见表1。

图1 ESW联合PRP对骨质疏松骨折大鼠影像学的影响(箭头标注为骨折处)

A：术后骨折固定情况；B～F：治疗8周后影像学表现；B：Control组；C：OVX组；D：OVX+ESW+PRP组；E：OVX+ ESW组；F：OVX+PRP组

图2 ESW联合PRP对骨质疏松骨折大鼠骨痂组织病理学的影响 HE×400

A：Control组；B：OVX组；C：OVX+ESW+PRP组；D：OVX+ESW组；E：OVX+PRP组

表1 ESW联合PRP对骨质疏松骨折大鼠生物力学的影响

与Control组比较：#P<0.05；与OVX组比较：*P<0.05

2.5 ESW联合PRP对骨质疏松骨折大鼠血清骨生化指标的影响如图3，治疗8周后，各组大鼠血清BALP、BGP及PICP水平的比较差异有统计学意义(F=5.423、5.391、5.360，P=0.001、0.001、0.001)；与Control组相比，OVX组大鼠血清BALP、BGP及PICP水平升高(P<0.05)；与OVX组相比，OVX+ESW+PRP组BALP、BGP及PICP水平降低(P<0.05)，而OVX+ESW组、OVX+PRP组BALP、BGP及PICP水平无变化(P>0.05)。

2.6 ESW联合PRP对骨质疏松骨折大鼠骨痂组织BMP-2通路蛋白的影响如图4，治疗8周后，各组大鼠骨痂组织中BPM-2、RUNX2及OSX蛋白的表达比较差异有统计学意义(F=28.122、39.182、30.028，P=0.000、0.000、0.000)；与Control组相比，OVX组大鼠骨痂组织中BPM-2、RUNX2及OSX蛋白的表达下调(P<0.05)；与OVX组相比，OVX+ESW+PRP组、OVX+ESW组和OVX+PRP组BPM-2、RUNX2及OSX蛋白的表达上调(P<0.05)，但OVX+ESW+PRP组上调幅度大于OVX+ESW组和OVX+PRP组(P<0.05)。

3 讨论

本研究采用OVX处理大鼠，发现大鼠骨密度降低，提示骨质疏松大鼠模型复制成功。ESW是一种具有力学性质的声波，主要通过振动、高速运动等导致介质极度压缩而富集能量，可影响介质物理性质，使其压强、温度、密度等发生跳跃式改变；且ESW可通过调节发生设备功率而控制能量大小，还可控制输出方向及形状实现靶向治疗，因此，ESW具有准确定位、精准调控的优势[6]。PRP中含有多种生长因子，在细胞增殖、分化、趋化及血管形成过程中有重要作用，可促进各类细胞的修复；大量基础实验和临床研究[7]报道，PRP可通过诱导前成骨细胞趋化和有丝分裂，上调胶原基质的合成，并阻碍破骨细胞生成、骨吸收，从而促进骨再生。但ESW联合PRP在骨质疏松骨折大鼠中的研究较少。

图3 ESW联合PRP对骨质疏松骨折大鼠血清骨生化指标的影响

A：Control组；B：OVX组；C：OVX+ESW+PRP组；D：OVX+ESW组；E：OVX+PRP组；与Control组比较：#P<0.05；与OVX组比较：*P<0.05

本研究表明，治疗8周后，OVX+ESW+PRP组并未出现完全愈合现象，但观察到大鼠骨折线OVX组明显模糊，提示ESW联合PRP可早期增强成骨细胞的增殖、分化活性。同一般骨折愈合过程相似，股骨骨折的愈合也包括纤维愈合期、骨痂形成期、骨性愈合期及改造塑形期等4个阶段，而股骨骨折中骨痂形成以软骨内成骨为主[8]。HE染色结果表明，ESW联合PRP能有效促进骨折处成骨细胞增殖、分化，产生大量的骨痂组织，并向成熟板状骨过渡，但各组大鼠愈合能力：对照组>OVX+ESW+PRP组>OVX组，表明骨质疏松明显影响骨愈合，可能是卵巢切除后体内雌激素水平明显下降，导致骨代谢紊乱，引起新生骨不足，从而延缓骨愈合。三点弯曲实验可反映骨的强度和抗外力的能力，其在预测骨折、评价骨愈合方面有重要作用。本研究显示，ESW联合PRP能有效增加骨折处的生物力学，与文献报道[9-10]结果基本相符。

图4 ESW联合PRP对骨质疏松骨折大鼠骨痂组织BMP-2通路蛋白的影响

A：Control组；B：OVX组；C：OVX+ESW+PRP组；D：OVX+ESW组；E：OVX+PRP组；与Control组比较：#P<0.05；与OVX组比较：*P<0.05

BALP、BGP及PICP是常见的骨形成指标。BALP可直接反映成骨细胞的活性及功能，BGP是反映骨形成速率的特异性指标之一，而PICP参与骨胶原合成过程，是骨的特异性标志物[11]。本研究结果显示，ESW联合PRP能下调大鼠BALP、BGP及PICP水平，降低骨转化率，促进骨折的愈合。据报道[12]，BMP-2信号通路能调控成骨细胞分化、扩增、矿化以及与破骨细胞耦联等过程。Wu et al[13]研究发现BMP-2基因敲除小鼠，均存在骨骼发育及成骨细胞功能缺陷，具体表现为骨质、成骨细胞数量减少及成骨细胞分化、矿化功能障碍。RUNX2是BMP-2的靶基因，是成骨细胞分化、骨发育的重要调节因子[14]。OSX也是BMP-2信号通路中重要的核转录因子，可调控多种成骨基因的表达[15]。本研究显示ESW联合PRP能够上调BMP-2信号通路，促进成骨细胞的分化及发育，增加骨质疏松大鼠骨密度，从而加速骨质疏松骨折大鼠骨愈合。另外，本研究结果显示，ESW与PRP可协同改善骨质疏松骨折大鼠生物力学性能及骨组织形态学，完成骨折修复，促进骨折愈合。后期还可采用不同方式构建骨质疏松骨折大鼠模型，深入探讨ESW联合PRP对骨质疏松骨折大鼠骨愈合的影响。