叶爱琴

（温州市中医院药剂科，浙江温州325000）

复合维生素B片是由维生素B13mg、维生素B21.5mg、烟酰胺10mg、维生素B60.2mg与右旋泛酸钙1mg组成的复方制剂，是一种维生素类非处方药，用于预防和治疗B族维生素缺乏所致的营养不良、厌食、脚气病、糙皮病等，其现行标准是原卫生部药典委员会制定的药品标准—化学药品及制剂（第一册），国外标准中未收载有相同处方的制剂。复合维生素B片作为一种口服固体制剂，现行标准中并没有溶出度的检查项目[1]，仅有崩解时限项目，有文献报道了复合维生素B片溶出度的研究[2]，但采用的是紫外分光光度法，方法准确性的专属性有待考察，溶出度测定结果是否能反映不同厂家产品的差异还值得探讨。本研究采用HPLC法建立了新的溶出度测定方法，不仅对处方中难溶性的维生素B2成分进行溶出度的测定，对不同转速、不同溶出介质的影响进行了考察，对55批样品的溶出度进行了测定，并对国内8个生产厂家的产品进行溶出曲线的考察，方法简便可靠，区分力强，能够为质量标准的提高和产品质量的评价提供实验依据。

1 材料

708DS型溶出度仪（配备850-DS取样收集系统，美国Agilent公司），Agilent1200 高效液相色谱仪（美国Agilent公司，包括紫外检测器、自动进样器和Chemstation色谱工作站），CPA225D型电子天平（德国赛多利斯公司，十万分之一）。维生素B2对照品（批号：100369-201504，含量98.2%，中国食品药品检定研究院提供），8批复合维生素B片样品均为质量考核抽样样品，规格：复方制剂，每片含维生素B13mg、维生素B21.5mg、维生素B60.2mg、烟酰胺10mg、右旋泛酸钙1mg（厂家a：批号18010601；厂家b：批号171004；厂家c：批号1709241；厂家d：批号20170902；厂家e：批号161105；厂家f：批号171205；厂家g：批号2171002；厂家h：批号1612006）；水为纯化水，磷酸二氢铵、磷酸为分析纯，庚烷磺酸钠、乙腈为色谱纯。

2 方法和结果

2.1 溶出度考察对象的选择 复合维生素B片所含的5个药物组分中维生素B1、维生素B6、烟酰胺、泛酸钙4个成分均在水中易溶，而维生素B2在水中极微溶解，即可得知本品溶出度结果取决于维生素B2这一难溶性成分的溶出情况，同时根据国家药品标准技术规范[3]的要求，复方制剂的溶出度应重点针对在水中微溶或不溶的活性成分，因此本研究选择维生素B2为溶出度测定的对象。

2.2 溶液的制备 维生素B2对照品溶液：精密称取维生素B2对照品适量，以水为溶剂加热振摇使维生素B2溶解并稀释制成约50μg/mL的溶液作为维生素B2对照品储备液，精密移取维生素B2对照品储备液5mL，置100mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。溶出介质：①pH值1.2的缓冲液（取盐酸4.59mL加水稀释至1000mL）；②pH值4.3的缓冲液（中国药典2015年版维生素B2片溶出度方法，以冰醋酸3mL与4%氢氧化钠溶液18mL用水稀释至600mL）[4]；③pH值6.8的缓冲液（取150mL0.2mol/L磷酸二氢钾溶液与67.2mL0.2mol/L氢氧化钠溶液混合后，再加水稀释至600mL，摇匀）；④水[美国药典USP39版RiboflavinTablets（维生素B2片）溶出度方法]。供试品溶液：精密称取样品细粉适量（相当于维生素B20.5mg）置200mL量瓶中，加水约150mL超声处理15min，使维生素B2溶解，稀释至刻度，摇匀，过滤，取续滤液。

2.3 溶出度测定方法的建立与验证

2.3.1 色谱条件：色谱柱：使用CAPCellPAKC18色谱柱（4.6mm×250mm，5μm），以含2mmol/L庚烷磺酸钠、50mmol/L磷酸二氢铵的溶液（取庚烷磺酸钠0.404g和磷酸二氢铵5.75g加水至1000mL，搅拌使溶解，用磷酸调节pH值至3.0）-乙腈（85：15）为流动相；流速：1.0mL/min；柱温：35℃；检测波长：267nm；进样量：20μL。在本色谱条件下，辅料对测定无干扰，维生素B2峰的保留时间为8.3min，见图1。

图1 高效液相色谱图

2.3.2 仪器精密度：取维生素B2对照品溶液连续进样6针，测得维生素B2峰面积的RSD为0.04%。

2.3.3 定量限：取维生素B2对照品溶液用水不断稀释并进样测定，当S/N为10左右时测得维生素B2的定量限浓度为0.01μg/mL。

2.3.4 线性关系考察：精密量取维生素B2对照品储备液25mL置于50mL量瓶中，加水稀释至刻度摇匀，精密量取该溶液0.25、0.5、1.0、2.0、2.5、4.0、5.0、6.0、10.0mL分别置50mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为维生素B2线性考察用测定溶液。取上述线性测定溶液进样测定，分别以峰面积A为纵坐标，以浓度C为横坐标，得到回归方程为A=96.267C-0.274，r=0.9999。由此可知，维生素B2在0.126～5.023μg/mL范围内线性关系良好。

2.3.5 重复性试验：精密称取样品（厂家c，批号1709261）细粉适量（相当于维生素B20.5mg）置200mL量瓶中，加水约150mL超声处理15min，使维生素B2溶解，稀释至刻度，摇匀，过滤，取续滤液即得。同法配制6份溶液，分别进样测定，计算平均含量为96.2%，RSD为0.8%。

2.3.6 回收率试验：精密称取已知含量的样品（厂家c，批号1709261）细粉适量（相当于维生素B20.25mg）9份，分别置250mL量瓶中，各精密加入维生素B2对照品贮备液1.25mL、5.0mL、7.5mL各3份，再加溶出介质约150mL超声15min使维生素B2溶解，放冷，稀释至刻度，摇匀，过滤，取续滤液分别作为50%、80%、100%供试溶液，每个浓度各制备3份溶液，分别进样测定，计算回收率，结果见表1。

表1 回收率试验结果

2.3.7 溶液稳定性：在避光操作条件下，按2.2.5项下的方法采用溶出介质配制供试品溶液1份，分别放置0、1、2、4、6、8、10、12、24h后进样考察供试品溶液的稳定性，计算得出维生素B2峰面积的RSD为0.3%，表明供试品溶液在24h内稳定。

2.4 溶解度试验 因维生素B2在水中溶解度极低，因此有必要考察其在不同pH溶出介质中的溶解度情况。称取维生素B2原料（上海阿拉丁公司，纯度＞98%）4份，各约0.1g分别置于锥形瓶中，分别精密加入100mLpH1.2、pH4.3、pH6.8的缓冲溶液和水，密塞，避光置于恒温振荡器中回旋振荡24h（恒温温度37℃，转速150r/min）。取出后迅速过滤，精密取续滤液5mL分别置于100mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，进样测定，计算溶解度结果见表2。

表2 维生素B2在37℃时不同介质中的溶解度（μg/mL）

2.5 溶出方法的确定和溶出曲线比较

2.5.1 试验装置和溶出体积的选择：本实验选择维生素B2作为溶出度测定的对象。参考国内外维生素B2片的溶出度方法，美国药典USP40版Ribofla-vinTablets（维生素B2片）和中国药典2015 年版维生素B2片均采用桨法进行溶出度的检查，又因本品为普通片剂，故选择桨法进行溶出度测定。维生素B237℃在不同pH值缓冲溶液中的溶解度均约为0.1mg/mL，按本品的规格（每片含维生素B21.5mg）计算，采用体积为100mL的溶出介质（全部溶解时的浓度约为0.015mg/mL）即可完全满足漏槽条件，同时，结合维生素B2HPLC测定方法的灵敏度，选择溶出介质的体积为600mL既能满足漏槽条件，又能适当提高灵敏度。

2.5.2 转速的选择：采用桨法考察转速的影响，取样品（厂家c，批号1709261），采用pH值1.2的缓冲液为溶出介质，体积600mL，分别以50、75r/min的转速进行溶出试验，在5、10、15、20、30、45、60、90min取样，滤过，同时补充溶出介质，取续滤液作为供试品溶液按上述色谱条件进行测定，绘制溶出曲线（见图2），结果显示，转速为50r/min时，溶出曲线上各点的累积溶出量均小于转速为75r/min的累积溶出量，而到达平台期后直至90min并没有再继续溶出，溶出曲线没有与转速为75r/min的溶出曲线相交，说明还有部分样品没有溶出，50r/min的转速不足以使片剂中维生素B2全部溶出。另外取另一个厂家的样品（厂家b，批号171004）进行试验，同法进行试验也得出相同的结论。因此，本方法选择转速为75r/min。

图2 不同转速的溶出曲线（厂家c，批号1709261）

2.5.3 溶出介质的确定：取样品（厂家c，批号1709261），采用桨法，转速为75r/min，体积600mL，分别在pH1.2、pH4.3、pH6.8的缓冲液和水4种溶出介质中进行溶出试验，按照2.5.2 的方法测定溶出曲线，结果见图3。根据图中的溶出曲线情况可知，转速为75r/min时在4种不同pH的溶出介质中，两批样品30min时溶出曲线均能达到90%以上，各点溶出量均比较接近，溶出曲线大致比较相似。另外，根据前述溶解度试验结果，维生素B2在这4种溶出介质中的溶解度相差不大，可以忽略，如采用水为溶出介质，省去配制过程，使实验过程更方便快捷，USP41版维生素B2片的方法亦采用水为溶出介质。综合上述情况，考虑选择水作为溶出介质。

2.5.4 取样时间的确定：根据上述各种溶出介质的溶出曲线，30min时已达到平台期，之后样品的累积溶出量变化不大，综合考虑，故确定取样时间为30min。

2.5.5 管路吸附考察：取以水为溶出介质的溶出液，在溶出曲线取样最后一个点时分别进行手动取样和仪器自动取样，结果手动取样和仪器自动取样得到样品的峰面积一致，表明溶出仪对维生素B2无吸附。

图3 不同溶出介质的溶出曲线（厂家c，批号1709261）

图4 不同厂家样品的溶出曲线

2.5.6 溶出曲线考察：采用中国药典2015年版四部通则中规定的桨法，以900mL盐酸溶液（稀盐酸24mL，加水至1000mL）为溶出介质，转速为50r/min，取8个厂家各1批样品，按2.3.3的方法测得溶出曲线，结果见图4。

3 讨论

3.1 维生素B2浓度测定方法的确定 复合维生素B片含有5 个组分，因此在本研究之前建立了采用HPLC梯度洗脱同时测定5个成分的含量测定方法。因本品溶出度只需考察维生素B2，因此在上述含量测定方法的基础上，改变流动相的比例，加快其他组分的快速洗脱，建立了维生素B2溶出度的测定方法，因此其他4个组分及辅料均对维生素B2无干扰，经过验证，准确度、精密度及灵敏度均符合溶出度测定的要求。本品1片中均含维生素B2仅1.5mg，如采用紫外可见分光光度法测定，辅料或其他组分会产生一定的本底吸收，会对测定结果产生一定的干扰，同时经试验研究表明，原标准中的含量测定方法采用分光光度法于444nm处测定维生素B2的含量，影响因素多，测定结果偏差大，不能准确反映样品的真实含量。试验结果显示维生素B2水溶液在224、267、375、444nm处均有最大吸收，DAD检测结果显示不管在什么波长处检测，HPLC法均可以使维生素B2与辅料得到分离，检测无干扰，但4个波长中267nm处的吸光度最大，是375nm和444nm处的吸光度的3倍以上，灵敏度最高，因此选择267nm作为检测波长。与文献[2]的研究相比，本研究中的HPLC法专属性更好，不受辅料及其他组分的干扰，测定结果会更准确。本方法中在避光操作条件下，供试品溶液中维生素B2在24h内均较稳定，说明方法的耐用性也较好，适合溶出度的测定。

3.2 关于参比制剂的问题及转速和溶出介质的选择 复方维生素B片为复方制剂，国内外均无法找到本品的原研制剂。因本研究中的方法只考察维生素B2这个难溶性组分的溶出情况，因此尝试选用维生素B2的单方原研片剂-维生素B2片作为参比制剂。然而一是维生素B2原研片难以获取，二则是对于维生素B2片，国家药品监督管理局药品审评中心在2017年12月9日发布的《289目录品种参比制剂基本情况表》中已明确“不推荐参比制剂”，原因是维生素B2片在FDA被列为OTC专论中的活性成分，橙皮书中未有收载[5]，因此本研究中没有选择参比制剂进行溶出方法的研究。

在本研究溶出方法的建立过程中，因没有合适的原研制剂作为参比制剂，所以选择了抽样样品中相对来说在国内比较知名的、市场占有率较高的品牌的产品来进行转速和溶出介质的考察，对4种不同pH值溶出介质均进行了考察，以提高溶出方法的可靠性。

3.3 结果和建议 根据溶出曲线考察结果显示，8个样品的溶出曲线差异明显：①厂家b样品的溶出最快，15min溶出达到90%；②厂家a、厂家c、厂家e和厂家f4个厂家样品的溶出曲线比较接近，30min时的溶出量均达到75%以上，只是厂家a和f前期溶出速率稍慢；③厂家d、厂家g、厂家h3个厂家的样品前期溶出缓慢，30min溶出量均在60%及以下，溶出速率较其他5个厂家的样品明显偏慢，其中厂家g的样品前期溶出较慢，但随着时间推移溶出越来越快，而厂家h的样品整个溶出过程溶出速率均较慢，90min时的溶出量仍不到80%，无法达到释放平台。此外，笔者还根据建立的溶出度方法对8个厂家的27批次样品的溶出度进行了检查，以75%为限度，结果显示有5个厂家共计7批次样品溶出度不合格。由于无法确定原研厂家及原研制剂，各厂家产品的溶出曲线好坏也无法准确评判，有待进一步研究，但复合维生素B片为普通崩解型速释片剂，厂家d、厂家g、厂家h3个厂家的产品30min溶出量均在60%及以下，与其他5个厂家的药品相比，溶出明显偏慢，说明这些厂家药品的制剂处方及工艺相对其他厂家来说存在一些问题，这些厂家应加强对药品的制剂处方、原辅料、工艺的研究以及对溶出度进行研究，以提高药品的有效性。