谷杭芝，张徐，王光演，林蓉蓉，胡燕

（温州医科大学附属第一医院妇科，浙江温州325015）

子宫内膜异位症（简称内异症）是一种妇科的常见疾病，是以宫腔以外部位（卵巢、大网膜、子宫直肠陷凹、腹壁、肺等）的活性子宫内膜细胞增殖、浸润为特点，在育龄期妇女的发病率为5%～10%，可引起顽固性、进展性、慢性盆腔疼痛，可导致不孕、月经异常，甚至有恶变的风险，严重影响育龄妇女的身心健康[1]。血管内皮生长因子（vascularendothelialgrowthfactor，VEGF）是内皮细胞的特异性丝裂原，是目前已知的作用最强的促血管生成因子之一，在血管生成过程中有十分重要的作用，同时也是一种有效的血管通透性诱导因子[2]。有研究表明VEGF的高表达与内异症的发生发展相关[3]，证明在内异症的发病过程中VEGF是一个重要的因子。对于VEGF基因多态性与内异症易感的关系，国外已有较多关于VEGF+405G/C、-460C/T、-634G/C、+936C/T、-1154G/A、-2578C/A等位点与内异症的相关研究已见报道[4-8]。而VEGF的rs3025040C/T、rs10434G/A两位点与内异症相关的研究却尚未见报道。本研究采用聚合酶链反应-限制性片断长度多态性（polymorphismchainreactionandrestrictionfragmentlengthpolymorphismanalysis，PCR-RFLP）分析技术对温州地区内异症患者和非内异症妇女的VEGF-rs3025040C/T、rs10434G/A位点基因多态性进行检测，以探讨VEGF基因多态性与内异症遗传易感性的关系。

1 资料和方法

1.1 一般资料 选取2014年3月至2015年3月在温州医科大学附属第一医院妇科接受腹腔镜手术的患者150例，术后标本均经过病理学证实为内异症，列为内异症组。严格按照美国生育学会1985年修订的内异症分期标准（r-AFS）将所有内异症组患者进行分期，其中I-II期内异症患者50 例，III-IV期患者100例。随机选取同时期本院健康体检者150例为对照组，通过询问既往史结合相关化验检查后排除内异症。本研究经医院伦理委员会批准。

1.2 试剂与仪器 血液基因组DNA提取试剂盒、2×TaqPCRMasterMix、50bpDNAladder、100bpDNAladder、DNAloadingbuffer购自天根生化科技（北京）有限公司，限制性内切酶AluI、HaeIII、HpaII购自NEB（北京）有限公司，紫外分光光度计购自美国Thermo公司，电泳仪购自北京百晶生物技术有限公司，PCR扩增仪购自德国MastercyclergradientEppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 基因组DNA提取：无菌操作下采集外周静脉血至少5mL，加入内置有0.85mL枸橼酸钠的试管中，混匀，放置于4℃冰箱保存备用（1周内检测）。按照血液基因组DNA提取试剂盒说明书操作提取基因组NDA。

1.3.2 基因多态性检测：基因检测采用PCR-RFLP技术。PCR反应体积为20μL体系，其中模板1μg，上游引物1μL，下游引物1μL，2×TaqPCRMasterMix10μL，双蒸水补足至20μL。酶切体系为：PCR扩增产物2.5μL、10×Buffer1μL、三蒸水6.3μL、限制性内切酶0.2μL，恒温水浴4h。将酶切产物经琼脂糖凝胶电泳，电脑成像系统成像分析。各位点引物序列、限制性内切酶及其酶切产物长度见表1-2。

表1 VEGF基因位点多态序列

表2 各位点特异引物及限制性内切酶

1.4 统计学处理方法 采用SPSS19.0 统计软件，组间的基因型及等位基因比较采用χ2检验。等位基因的相对危险度用OR值和95%CI表示。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 对照组Hardy-Weinberg平衡检验 应用Hardy- Weinberg公式计算出对照组中VEGF-rs3025040和VEGF-rs10434基因型频率观察数与期望数，两者间差异无统计学意义（P＞0.05），表明本研究对照组资料具有群体代表性（见表3）。

表3 Hardy-Weinberg平衡检验

2.2 2组VEGF-rs3025040C/T位点多态性等位基因和基因型分布及比较 内异症组VEGF-rs3025040C/T位点等位基因C频率显著高于对照组，差异有统计学意义（χ2=23.762，P ＜0.001，OR=1.800，95%CI=1.410～2.298），提示在VEGF-rs3025040C/T位点上携带有C等位基因的妇女患有内异症风险是携带T等位基因妇女的1.800倍。内异症组VEGFrs3025040C/T位点多态性存在CC、CT、TT3种基因型，2组基因型分布比较结果显示，在不同基因型分布上2组差异有统计学意义（χ2=43.509，P＜0.001）。见表4。

2.3 2组VEG-rs10434G/A位点多态性等位基因和基因型分布及比较 2组VEGF-rs10434G/A位点等位基因分布差异有统计学意义（χ2=34.084，P＜0.001，OR=1.340，95%CI=1.207～1.497），提示在VEGF-rs10434G/A位点上携带有A等位基因的妇女更易得内异症。VEGF-rs10434G/A位点多态性存在GG、GA、AA3种基因型，2组基因型比较差异有统计学意义（χ2=57.550，P＜0.001）。见表4。

表4 VEGF-rs3025040C/T位点和VEGF-rs10434G/A位点基因型和等位基因分布[每组n=150，频数（%）]

3 讨论

VEGF是FERRARA等[2]在牛垂体滤泡星状细胞培养液中得到的一种寡二聚体糖蛋白，相对分子质量为35～45kDa。VEGF是内皮细胞的特异性丝裂原，是目前已知的作用最强的促血管生成因子之一，同时也是一种有效的血管通透性诱导因子[9]。目前已有的研究表明在内异症的发病过程中VEGF是一个重要的因子[10]。子宫内膜脱落的内膜碎片可能具有先天血管生成潜能。人的子宫内膜由功能层和基底层组成，是唯一一个在卵巢类固醇激素-雌激素和孕激素调节下随着月经周期而发生周期性的增殖、分化、退化的器官。在每个月经周期随着内膜的生长，内膜血管系统在卵巢类固醇激素，尤其是雌激素的作用下经历着增殖和退化的变化。SHIFREN等[11]检测了增殖期和分泌期功能层的VEGFmRNA增加程度，表明在每个月经周期都有血管新生的发生。他进一步发现，雌激素能刺激VEGF的表达，与对照组相比，加了雌激素后VEGFmRNA的水平显著升高。从理论上说内异症是由内膜碎片在腹腔种植而成的。健康的内膜在雌激素的调节下展现出了先天的血管生成潜能，并且在同一实验中证实了VEGF的异常表达和雌激素水平的异常会促进内异病灶的新生血管生成。事实上，VEGF在促进内异症的血管新生过程中起到了重要的作用。它是一种血管活性物质，在很多的生理过程包括创口愈合和内膜的血管重建中调节内皮细胞的增殖和迁移。在肿瘤的发生过程中，VEGF浓度与血管密度增加显著相关。在正常的内膜中，VEGF的mRNA和蛋白表达水平可被缺氧所驱动[3]。与早期内异症患者和健康人相比，晚期内异症患者的腹腔液中具有更高浓度的VEGF[12]。另外，内异症患者腹腔液和血浆中升高的VEGF浓度与内异症病灶细胞的增殖活性和微血管密度呈正相关[13]。内异症病灶和腹腔巨噬细胞在雌孕激素的作用下会增加VEGF的表达[14-15]，成为VEGF的来源。此外，不同类型的免疫细胞通过产生促炎性和血管生成细胞因子，同时又增加其在内异症病灶暴露的腹腔液中的浓度来参与血管形成[15]。LIN等[16]发现内异症病灶的血管形成发生在分泌VEGF的中性粒细胞和巨噬细胞向病灶和腹腔浸润之后，阐明了免疫细胞的重要性，人类的子宫内膜功能层具有独特的在周期性脱落后出现周期性的增殖和退化的变化，因此子宫内膜碎片进入腹腔后仍具有血管生成能力。

人的VEGF基因位于染色体的6p21.3，长14kb，由8 个外显子和7 个内含子交替组成。VEGF基因至少有30 个单核苷酸多态性位点，如+405G/C、-460C/T、-634G/C、+936C/T、-1154G/A、-2578C/A等。这些基因多态性可能通过影响VEGF的转录或表达而影响肿瘤的发生、发展和预后。对于VEGF基因多态性与内异症易感的关系国外有较多报道。ALTINKAYA等[5]研究表明+405G/CG等位基因的存在与内异症的发病有关。有研究[17-18]指出，VEGF-460C/T和+405G/C多态存在连锁不平衡，-460T/+405C单倍型与低启动子活性有关，携带+405G等位基因可能增加内异症的发病风险；KIM等[8]报道韩国妇女携带CC基因型的罹患风险增加1.99倍；早期IKUHASHI等[7]研究发现VEGF+936C/T的T等位基因可能增加III-IV期内异症的患病风险，HENIDI等[6]也得到了相似的结果。而林蓉蓉等[19]研究发现MIF基因多态性与腹壁内异症遗传易感性相关，提示我们基因多态性与内异症的发生相关。刘青等[20]研究发现携带VEGF-1154GG和-2578CC基因型显著增加内异症的发病风险，而其中单倍型VEGF-460/-1154/-2578TGC、CAA、TAA和TAC与内异症的发病明显相关。VEGF+936C/T基因多态性可能与内异症的发生发展有关，C等位基因可能是内异症的易感基因[21]。

而在本研究中新纳入的2 个VEGF多态性位点rs3025040C/T和rs10434G/A在内异症发病中均具有显著性意义，rs3025040C/T的C等位基因和rs10434G/A位点的A等位基因均增加内异症的罹患风险，为预测妇女内异症的发病风险，筛选出高风险的妇女，尽可能降低发病风险，或积极干预减轻病情进展奠定实验基础。但VEGFrs3025040C/T的C等位基因和rs10434G/A位点的A等位基因，如何调控内异症的发生发展，有待进一步研究证实。