李 娜 武恩斯 闻小霞 赵新宇 李岩杰 曹修才

（聊城市农业科学研究院，山东聊城252000）

山东省聊城市栽培平菇已有30多年的历史，且主要集中在东昌府区、临清、冠县等。2018年全市食用菌总投料达68.95万t，栽培面积1 303 hm2，总产量50.26万t，其中平菇产量37.55万t，位居第一。近年来平菇球形菇成为当地平菇生产上主要病害，经调查，除聊城东昌府区多年使用的老菇棚外，在东昌府区、临清市等新建菇棚内，不论是冬暖大棚层架式栽培还是半地下墙式栽培模式，平菇球形菇均普遍发生，给菇农造成严重经济损失。

王庆武等认为栽培环境条件、管理措施和农药药害是产生球形菇的主要原因[1]。师迎春等认为平菇被平菇球形病毒（oyster mushroom spherical virus，OMSV）侵染后，出现菌丝退化，菌柄短粗等症状，造成平菇球形菇发生[3]。而平菇球形菇病症早期不易发现，出菇才显症，不易防控。

为了解聊城市球形菇的发生情况，查找球形菇发生的原因，笔者实地调查采样，并对样本进行组织分离培养，同时利用特异性引物对样本平菇球形病毒（oyster mushroom spherical virus，OMSV）进行检测。现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 样本采集

2017年12月—2018年3月在山东省聊城东昌府区、临清等区（县）平菇栽培地采集表现畸形、子实体小、呈喇叭花状、花束状丛生的平菇样品11份，样本编号整理后存放在4℃冰箱内，及时进行组织分离。

1.2 组织分离

将样品放入超净工作台，在菌盖与菌柄交界处切取小块菌肉，迅速接入PDA平板中部，25℃培养，3～5 d后即可看到组织块周围长出白色稀疏纤细的菌丝。

1.3 转接平板培养菌落的观察和测定

取1.2菌丝琼脂块（0.7 cm×0.7 cm）转接在无冷凝水的PDA平板上，25℃培养。每个样本3次重复用。“十”字交叉法，测量培养120 h后的菌落直径，计算菌丝平均生长速度。

菌丝平均生长速度（cm/d）=菌落半径（cm）/菌丝生长天数（d）。

1.4 RT-PCR检测平菇球形病毒

取1.3培养菌丝接入液体培养基中，液体培养7 d后，3 000 r/min离心收集菌丝体，Trizol法或植物RNA提取试剂盒提取菌丝总RNA，然后进行反转录，得到cDNA。用平菇球形病毒（OMSV）特异引物[3]（OMSV4910F 5'-TACCCCCCCAGGATCTCAAGCTTCT-3'和OMSV5556R 5'-TGAAAGCGCGTCCAT-CAGAACCATTC-3'），扩增基因部分片段。PCR 反应体系（25µL）：cDNA 3µL，dNTPs（10 mmol/L）0.5µL，上下游引物各0.5µL，10×反应缓冲液2.5µL，Taq DNA聚合酶0.25µL（5U/µL），ddH2O 17.75µL。PCR反应条件：95℃ 3 min，95℃30 s，55℃ 45 s，72℃ 1 min，35个循环；72℃延伸10 min，4℃保温[3]。全部PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳分离后观察到明亮的条带后，送华大基因测序。

2 结果与分析

2.1 采集样品

采集的样本见图1。

2017年12月—2018年3月在聊城平菇主要栽培区东昌府区、临清市平菇棚区采集表现畸形、子实体小、呈喇叭花状11份平菇样本，涉及六个品种，分别为抗2、抗3、8129、8105、969、德丰5号；采集地分布在临清烟店、尚店，东昌府区闫寺、堂邑、米炉等地。

2.2 组织分离菌丝培养性状

样品组织分离后，取0.7 cm×0.7 cm菌块转接培养。5 d后观察，11份样品中，8129平菇菌株（3号）菌丝几乎未生长，其余样品（除4号抗2外）菌落生长边缘均不规则，整齐度差，菌丝生长缓慢；除3号外剩余10个样品菌落长满平板（直径9 cm）的时间在7.8～15.1 d，而且多数菌丝生长15 d后产生橘红色素（表1，图2）。

图1 聊城市采集部分平菇球形菇样本

图2 样本培养5 d菌落（1-11号）及部分样本（A-D）培养15 d状态（产生橘红色素）

表1 样本组织分离培养菌丝观察测定结果

2.3 RT-PCR检测平菇球形病毒

利用特异引物OMSV4910F/OMSV5556R进行RT-PCR检测10个球形菇培养的菌丝体（3号菌丝未生长，未进行检测），均得到约700 bp的基因片段。通过测序和序列比对分析表明，扩增得到的基因序列为OMSV标准序列（ID：NC_004560.1）的部分基因核酸序列，经BLAST比对，相似度在90.8%～91.2%。序列分析结果表明，此次采集的平菇样品均被平菇球形病毒（OMSV）感染。

图2 聊城市平菇球形菇样本中球形病毒（OMSV）检测电泳图

3 小结与讨论

平菇球形菇已成为制约聊城市平菇产业发展的重要因素。对聊城东昌府区、临清市等地平菇球形样品的检测结果说明，采集到的病样均能检测到平菇球形病毒。

平菇感染平菇球形病毒后，前期只是表现为菌丝生长速度减慢，出菇后才表现出菌柄肿胀呈漏斗或喇叭花状等朵形球状明显症状，因此难以做到及时防控，目前尚无有效的生物或化学防治手段[3]。

笔者结合生产实际，提出如下防控建议供参考：（1）稳定可靠的菌种来源，从源头上控制菌种质量。应使用符合GB/T 21125—2007食用菌品种选育技术规范要求[5]选育的品种，且清楚种性，并从具有相应技术资质的供种单位引种；菌种运输过程中确保有防晒、防潮、防雨、防冻、防振以及防止杂菌污染的设施和措施，从源头确保菌种质量。（2）严格筛选优质母种。母种出现菌丝羸弱、形状扭曲不规则、颜色暗黄以及保存时间超过1个月应全部剔除；严控转管次数，剔除长势过强及过弱的菌株，保证母种活性及一致性。（3）切断传播途径，降低感染概率。接种操作规范；菇棚设置60目防虫网防虫；已发生球形菇的菇棚，空气中喷雾，阻止带毒孢子飞扬，并在生产结束后加强菇棚及土壤消毒。

试验中样本组织分离菌丝长势较差，出现菌种退化现象，特别是8129、德丰5号两个品种。因未调查菌种来源，故而无法得出病毒的发生是因为菌种本身带毒还是因为菌株退化，抗性降低，后期感染所致。因此有待进一步调查研究。