陈梅梅 杨春敏 莫美华

（1广州工商学院，广东广州510000；2华南农业大学，广东广州510000）

巨大口蘑（Tricholoma giganteum），又名洛巴口蘑、大白口蘑，商品名有金鞭口蘑、金福菇、香口蘑、荆西口蘑等，属担子菌亚门，层菌纲，伞菌目，口蘑科（白蘑科），口蘑属（白蘑属）[1]，原产于热带地区，主要分布在非洲、南亚次大陆，我国台湾、福建、广东、香港、云南等地均有不同程度的自然分布[2]。

巨大口蘑具有较高的营养价值，富含蛋白质、多糖、脂肪、纤维素和多种矿质元素[3]，其干制品中的蛋白质和多糖含量分别高达36.59%和11.59%，均高于鸡、松茸，是一种优质食用菌[4]。

大多数食用菌采摘后很快褐变、腐烂，无法远距离运输，难以贮藏。而巨大口蘑在8～12℃条件下，贮藏30 d不变色，耐贮性好，与其他食用菌相比有较强抗褐变特性[5-7]。但目前对巨大口蘑抗褐变机理的研究较少，故需要从分子生物学的角度出发，溯本求源，克隆出巨大口蘑酪氨酸酶基因的全长，与Genebank中双孢蘑菇酪氨酸酶基因做比对分析，找到两者之间差异性表达的根源，为培育抗褐变新品种提供理论依据。高质量的总RNA提取是分子生物学研究的基础和关键步骤，而目前提取巨大口蘑总RNA的方法鲜有报道。因此笔者对巨大口蘑子实体总RNA的提取方法进行研究。

1 材料与方法

1.1 供试材料

新鲜的巨大口蘑子实体（广州粤旺农业有限公司提供），液氮冷却后，-80℃保存备用。

1.2 主要试剂与耗材

2%CTAB十六烷基三甲基溴化铵（Cetyltrimethylammonium bromide）缓冲液；2%PVP（Polyvinylpyrrolidone）（W/V）；25 mmol/L EDTA（Ethylenediaminetetraacetic acid）；100 mmol/L Tris-Cl（Trihydroxymethyl aminomethane-HCl）（pH 8.0）；2.0 mol/L Na-Cl；0.5 g/L亚精胺；2%β-巯基乙醇；Trizol（Invitrogen公司）；E.Z.N.A.Total RNA Kit I试剂盒（OMEGA公司）；SSTE buffer：11.68 g NaCl，1.0 g SDS，0.059 g EDTA；用于提取RNA的研钵（烘箱中加热至160℃维持2 h）、药匙、镊子等用具均用0.1%DEPC（diethyl pyrocarbonate）处理过夜备用；无RNA酶的专用枪头、PCR管、1.5 mL 离心管、10 mol/L LiCl、dd H2O经121℃高压灭菌30 min，60℃烘干备用；无RNA酶的β-巯基乙醇、70%乙醇（DEPC水配置），一次性手套等。

1.3 巨大口蘑总RNA的提取

1.3.1 Trizol提取方法

（1）向无RNA酶的2 mL离心管中加入1 mL Trizol备用；（2）液氮中迅速研磨新鲜子实体或将1.5 g左右-80℃保存备用的子实体研磨成粉末状；（3）按照每50～100 mg的样品加1 mL Trizol提取液的比例取样，向加有Trizol的离心管中加入相应量的样品，注意样品的体积不超过提取液的10%；（4）将样品和提取液用力振荡混合摇匀后，在15～30℃下静置5～10 min；（5）4 ℃，17 925×g，离心15 min，小心吸取400µL左右上清液至新的离心管中；（6）向上清液中加入0.5 mL异丙醇，轻摇匀后室温静置10 min；（7）17 925×g，4 ℃离心10 min，在管底出现白色沉淀，即为RNA；（8）去掉上清后，向离心管中加入DEPC水配制75%乙醇，振荡混匀；（9）7 500 r/min，4℃离心5 min，除去上清液倒置在滤纸上，室温干燥15～20 min，注意不能将RNA完全干燥；（10）加入45µL ddH2O溶解RNA，待完全溶解后于-80℃保存备用。

1.3.2 E.Z.N.A.Total RNA Kit I试剂盒提取方法

（1）液氮中迅速研磨1.5 g新鲜巨大口蘑子实体或将-80℃保存的巨大口蘑子实体研磨至粉末状，加入600µL的TRK裂解液（每1 mL TRK裂解缓冲液加入20µL的β-巯基乙醇）；（2）向裂解产物中加入等体积（350µL或600µL）70%乙醇，轻轻混匀；（3）把所得混合样品加到Hibind RNA柱子上，柱子的最大容量为750µL，加完乙醇后可能会形成沉淀，所以要充分振荡，之后将所有的混合液加到柱子上，把柱子放入一个2 mL的收集离心管中，室温离心，14 938×g，30～60 s，弃流出液；（4）将柱子放在一个新的2 mL收集管中，加上300µL RNA wash buffer I到柱子上，室温离心，14 938×g，30～60 s，弃流出液；（5）将柱子放回2 mL收集管中，加入500 µL RNA wash buffer I，室温离心，14 938×g，30～60 s，弃流出液；（6）将柱子放到一个新的2 mL收集管中，加入500µL RNA wash buffer II，室温离心，14 938×g，30～60 s，弃流出液；（7）用 500µL RNA wash buffer II洗涤一次柱子，室温离心，14 938×g，30～60 s，弃流出液，再把柱子放回收集管中，14 938×g，2 min，室温离心，以甩干柱子基质；（8）转移柱子到一个新的1.5 mL的离心管中，加入30～100µL的ddH2O洗脱柱子，室温静置2 min，14 938×g，离心1 min，洗脱出RNA。

1.3.3 CTAB-LiCL提取方法

（1）将CTAB提取液置于65℃水浴中预热；（2）液氮中研磨1.5 g左右新鲜巨大口蘑子实体或-80℃冷冻巨大口蘑子实体；（3）转移样品至有15 mL预热之后的CTAB提取液的离心管中，剧烈振荡30 s，放回 65℃水浴静置 2～5 min；（4）加入等体积的氯仿/异戊醇并振荡混合，4 ℃，14 938×g，离心15 min；（5）将上清液转移到另一新离心管中，重复抽提一次；（6）再将上清液转移到另一新离心管中，加入1/3体积的LiCl，4℃下沉淀过夜（最长16 h）；（7）4℃，17 925×g，离心15 min（全速），弃上清，加入500µL 70%乙醇润洗沉淀，再用500µL 100%乙醇润洗沉淀；（8）用500µL SSTE 溶解沉淀，转移到1.5 mL离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇再抽提一次；（9）加入2×体积的无水乙醇，在-80℃沉淀30 min或-20 ℃沉淀2 h；（10）4 ℃，14 938×g，离心20 min，弃上清；（11）分别用400µL 70%乙醇和400µL 100%乙醇洗沉淀，加入，45µL ddH2O溶解RNA。

1.4 RNA提取质量检验及浓度计算

1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA纯度和完整性，紫外凝胶成像仪观察并拍照；取10µL RNA样品，用TE或蒸馏水稀释50倍，用TE或蒸馏水做空白，调节紫外分光光度计的读数至零，加入待测RNA样品，分别测定A260、A280、A230、RNA含量（µg/µL）。

2 结果与分析

2.1 RNA 1%琼脂糖凝胶电泳检测

RNA凝胶电泳图谱可以快速评判所提取的总RNA的完整性，完整的RNA电泳图谱应该可以清晰地看到28S、18S和5S RNA条带，且28S RNA条带的亮度约为18S RNA条带的2倍，因此通过图谱中各条带的带形和亮度可以判断RNA的提取质量。在质量分数为1%琼脂糖凝胶上，用上述3种方法所提取的巨大口蘑子实体总RNA的电泳结果如图1所示。

图1 3种方法提取的巨大口蘑子实体RNA凝胶电泳检测结果

从图1中可以清晰地看到A、B、C各有2条明亮的RNA条带，从上往下分别为28S RNA和18S RNA，且28S RNA条带的亮度远远超过18S RNA条带的亮度，说明3种方法都可以提取巨大口蘑子实体总RNA。总RNA浓度越高条带亮度越高，其中试剂盒法提取的总RNA条带亮度相对较弱，而CTABLiCl法提取的总RNA条带亮度较强，带形完整，说明提取质量较高。

2.2 总RNA纯度及浓度检测

比较分析3种提取方法提取的巨大口蘑子实体总RNA纯度和浓度，结果表明（表1）：3种方法虽均能提取巨大口蘑总RNA，但浓度和纯度有所不同。

表1 3种提取方法提取的巨大口蘑总RNA纯度及浓度

CTAB-LiCl法提取的巨大口蘑总RNA的A260/A280是1.92，A260/A230是2.25，浓度为235 µg/g，说明其完整且纯净；Trizol法和试剂盒法提取的巨大口蘑总RNA的A260/A230均小于2.0，说明提取RNA中存在蛋白质、多酚等杂质（杂质越多RNA纯度越低），其浓度分别为147µg/g和89µg/g。因此，在后续的试验中均采用CTAB-LiCl法提取总RNA，此结论与以上RNA琼脂糖凝胶电泳检测结果一致。

3 小结与讨论

分子生物学技术是食用菌研究的一个重要手段，已经广泛应用到食用菌研究中[8]。而提取总RNA的质量是一切后续分子生物试验的基础。

由230 nm、260 nm和280 nm紫外吸收波长不同组合的比值、总RNA浓度以及琼脂糖凝胶电泳检测结果可以判断，巨大口蘑子实体总RNA提取方法的最优选择是CTAB-LiCl法。

巨大口蘑子实体富含蛋白质与多糖，且多糖的理化性质与RNA非常相似，提取时很难将二者区分开来，因此找到一种能够满足巨大口蘑抗褐变分子机理研究的总RNA提取方法十分重要。要想获得富含多糖多酚的植物组织和产量高、完整性好的RNA，必须完全破碎植物细胞（细胞破碎不完全RNA不会完全游离出来，产量则下降）；且去除多糖和抑制内源RNA酶活性是巨大口蘑总RNA提取成功的关键[9]。试验分析比较了Trizol法、CTAB-LiCl法和试剂盒法提取巨大口蘑子实体总RNA的效果，结果表明3种方法均能保证RNA的完整性，但是Trizol法和试剂盒法提取的RNA纯净度有待提高，且得率不如CTAB-LiCl法。分析其原因：①巨大口蘑子实体含有较多蛋白质，而CTAB作为裂解液，是一种强变性剂，能够有效地去除蛋白质（包括复合蛋白质）等杂质；②巨大口蘑子实体富含多糖和多酚类物质，而在提取液中加入PVP及β-巯基乙醇能有效地去除组织中的酚类物质和多糖，提高RNA的完整性和纯度[10]；③在常用的去除多糖的方法中，用LiCl沉淀RNA是RNA提取中最常用的方法，更适于后续的分子生物学试验[11]。所以CTAB-LiCl法提取巨大口蘑总RNA效果最好。

琼脂糖凝胶电泳检测结果显示，试剂盒法提取的总RNA条带较多，可能是在提取过程中发生了不同程度的降解。因此，在试验过程中应该严格按照试验步骤和要求，在低温环境中进行，尽量减少RNA的降解。