陈兵兵 宓晓晴 李云 谢俊霞 宋宁

[摘要] 目的 探究柠檬酸铁胺（FAC）对SH-SY5Y多巴胺能细胞系葡萄糖脑苷脂酶（GCase）活性及其蛋白表达的影响。方法 用FAC、GCase活性抑制剂环己烯四醇环氧化物（CBE）分别或共同处理细胞48 h，应用荧光法检测GCase活性，免疫印迹法检测GCase蛋白表达。结果 FAC和CBE两种因素共处理，对GCase活性及其蛋白表达的影响不存在交互作用（P>0.05）。FAC处理SH-SY5Y细胞后，GCase活性降低，蛋白表达升高，与对照组比较差异具有统计学意义（F=8.191、4.934，P<0.05）;CBE处理SH-SY5Y细胞后，GCase活性降低，蛋白表达升高，与对照组比较差异具有统计学意义（F=14.605、4.182，P<0.05）。结论 高铁可降低SH-SY5Y细胞中GCase的活性，升高蛋白的表达。

[关键词] 铁;柠檬酸盐类;葡糖苷酰鞘氨醇酶;SH-SY5Y细胞

[中图分类号] R338.1;R345.62  [文献标志码] A  [文章编号] 2096-5532（2020）02-0143-04

doi：10.11712/jms.2096-5532.2020.56.058 [开放科学（资源服务）标识码（OSID）]

[网络出版] http：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20200407.0930.004.html;2020-04-07 14：57

[ABSTRACT] Objective To explore the effect of ferric ammonium citrate （FAC） on glucocerebrosidase （GCase） activity and expression in SH-SY5Y dopaminergic cells.  Methods SH-SY5Y dopaminergic cells were treated with FAC and the GCase inhibitor conduritol B epoxide （CBE）， alone or in combination， for 48 h. Fluorometric assay was used to determine the GCase acti-vity. Western blotting was performed to determine the expression level of GCase.  Results When FAC and CBE were used in combination to treat the SH-SY5Y cells， there was no interaction between them with regard to the effect on GCase activity and expression （P>0.05）. SH-SY5Y cells treated with FAC alone showed a significantly decreased GCase activity and a significantly increased GCase expression level compared with the control group （F=8.191，4.934，P<0.05）; SH-SY5Y cells treated with CBE alone also showed a significantly decreased GCase activity and a significantly increased GCase expression level compared with the control group （F=14.605，4.182，P<0.05）.  Conclusion High level of iron can decrease the activity and increase the expression level of GCase in SH-SY5Y cells.

[KEY WORDS] iron; citrates; glucosylceramidase; SH-SY5Y cells

近年来遗传基因的发现为家族性和散发性帕金森病（PD）的发病机制提供新见解，有5%～10%的PD病例是遗传因素所致[1-2]。临床研究发现，PD病人中编码葡萄糖脑苷酯酶（GCase）的基因GBA突变率达20%，因此GBA突變是目前已知的PD和相关突触核蛋白病发展的最常见的遗传危险因素[3-5]。GCase是一种具有497个氨基酸的膜相关性蛋白，该蛋白在内质网中合成和经糖基化修饰后，被溶酶体膜整合蛋白-2转运至溶酶体中，发挥生物学功能[6]。GCase活性的降低可以导致葡萄糖神经酰胺的聚积，进而导致戈谢病的发生[7]。在PD中，GBA突变降低了GCase的活性，导致α-突触核蛋白聚集，而聚集的α-突触核蛋白又进一步促进了GCase活性的降低，形成恶性循环，造成多巴胺能神经元的死亡，因此GCase的活性与PD的发病进程密切相关[8-12]。铁是PD发病的重要因素之一[13]，铁可以诱导氧化应激和铁死亡等[14-16]，从而造成多巴胺能神经元的选择性损伤。然而，目前关于铁对GCase活性及其蛋白表达的影响尚未见报道。因此，本研究应用柠檬酸铁铵（FAC）制备SH-SY5Y多巴胺能细胞系的高铁模型，并使用GCase的不可逆竞争性抑制剂环己烯四醇环氧化物（CBE）作为对照药，探讨铁对GCase活性及其蛋白表达的影响。现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料

SH-SY5Y细胞系由中国科学院上海细胞库提供，DMEM高糖基础培养液、胎牛血清（FBS）购自以色列BI公司，4-甲基伞形酮-β-葡萄糖苷（4-MU-β-GLC）、CBE、FAC和GCase一抗购自美国Sigma公司，β-actin抗体、HRP-IgG标记的二抗购自北京博奥森公司，ECL发光液为Millipore公司产品，其他试剂均为国产分析纯。

1.2 SH-SY5Y细胞的培养

实验前将实验器具高压灭菌。从液氮中取出冻存的SH-SY5Y细胞转移到37 ℃水浴中迅速（30 s内）解冻，充分摇匀后置于离心机中，以1 000 r/min离心5 min，弃去上清，加入完全培养液吹打均匀后接种到25 cm2细胞培养瓶中，光镜下观察细胞是否贴壁，然后置于培养箱中（37 ℃、含体积分数0.05 CO2）培养，每隔2 d传代1次。

1.3 实验分组及处理

将SH-SY5Y细胞分为对照组（A组）、FAC处理组（B组）、CBE处理组（C组）、FAC和CBE共处理组（D组）。将SH-SY5Y细胞以2×104/cm2的密度接种于6孔板中，每孔加入1.5 mL的细胞混悬液。当细胞达到50%～70%融合时，对照组加入新鲜无血清的培养液;FAC处理组加入100 μmol/L的FAC;CBE处理组则加入100 μmol/L的CBE;FAC和CBE共处理组先加入100 μmol/L的CBE预孵育30 min，再加入100 μmol/L的FAC。上述各组药物处理时间均为48 h。

1.4 GCase酶活性的测定

药物处理48 h后每孔加入100 μL的磷酸盐缓冲液，于冰上静置30 min后用刮板刮下细胞并在细胞破碎仪中破碎，破碎强度为30%;在4 ℃下以12 000 r/min离心10 min;取2.5 μL的上清，加入5 mmol/L的4-MU-β-GLC 12.5 μL，37 ℃孵育30 min后，加入1 mol/L的甘氨酸缓冲液（pH值=10）终止反应。在酶标仪上设定激发光波长EX=360 nm、发射光波长Em=460 nm，检测产物4-甲基伞形酮的含量，以相对荧光单位（RFU）表示，并应用BCA蛋白定量试剂盒检测提取样品的蛋白浓度（RFU/μg总蛋白）。

1.5 免疫印迹法检测GCase蛋白表达

药物处理48 h后提取蛋白，用BCA蛋白定量试剂盒检测提取蛋白的浓度，以每孔总蛋白量为20 μg计算蛋白上样量，加入Loading Buffer，95 ℃煮5 min。经120 g/L的SDS-PAGE凝胶电泳后湿转到0.45 μm 的PVDF膜上，室温下用100 g/L的脱脂奶粉溶液封闭2 h，再分别加入GCase（1∶1 000）和β-actin（1∶10 000）一抗于4 ℃摇床过夜。第2天用山羊抗兔的HRP-IgG（1∶10 000）孵育1 h后以TBST溶液洗3次，每次10 min，ECL发光液显影后用Image J统计结果。

1.6 统计学处理

应用SPSS 22.0软件进行统计分析，实验结果以±s表示，针对FAC和CBE两种处理因素，采用析因设计的方差分析进行处理，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结  果

2.1 FAC对GCase活性的影响

析因设计方差分析显示，FAC和CBE这两种因素对GCase活性的影响不存在交互作用（P>0.05），因此进一步分析FAC、CBE主效应的结果是否具有统计学意义。100 μmol/L FAC处理SH-SY5Y细胞48 h后，FAC处理组酶活性较对照组有明显的下降，差异有统计学意义（F=8.191，P<0.05）;在CBE处理SH-SY5Y细胞48 h后，CBE处理组酶活性也较对照组明显下降，差异有统计学意义（F=14.605，P<0.05）。见表1。

2.2 FAC对GCase蛋白表达的影响

析因设计方差分析显示，FAC和CBE两种因素不存在交互作用（P>0.05），因此进一步分析FAC、CBE主效应是否有统计学意义。100 μmol/L FAC处理SH-SY5Y细胞48 h后，FAC处理组蛋白表达较对照组明显上调，差异有统计学意义（F=4.934，P<0.05）;在100 μmol/L CBE处理SH-SY5Y细胞48 h后，CBE处理组与对照组比较蛋白表达明显上调，差异有统计学意义（F=4.182，P<0.05）。见表1。

3 讨  论

PD的发病机制迄今未明，研究表明遗传因素、环境因素和老化因素均可参与PD中多巴胺能神经元的变性死亡过程[17-19]。据文献报道，在PD病人的黑质（SN）中铁的总量随疾病严重程度的增加而增加[20-23]，这些过量的不稳定性铁可通过Fenton反应催化产生具有高细胞毒性的羟自由基[14，22-25]，导致细胞死亡，从而造成疾病的发生。在GBA突变的PD病人的小脑、壳核、杏仁核、SN中GCase活性降低，其中以SN最明显。同时，在非GBA突变的散发性PD病人小脑和SN中GCase活性也明显下降[26-27]。在6-羟基多巴胺制备的PD大鼠模型中，检测到SN和纹状体的GCase活性下降[28]。

本实验用100 μmol/L FAC、100 μmol/L CBE处理SH-SY5Y多巴胺能神经元细胞系，研究铁对GCase活性及蛋白表达的影响。文献报道，溶酶体内的酶都是水解酶，而且一般最适pH值为5.0，所以都是酸性水解酶[29]。有研究表明，在铁负载的细胞中，溶酶体pH值从5.0增加到5.7，高铁破坏了细胞内溶酶体的酸性环境[30]。本研究结果显示，在FAC处理SH-SY5Y细胞48 h后，GCase的活性明显降低，提示细胞内的高铁环境破坏了溶酶体内的酸性环境，从而使GCase的活性降低。而GCase活性的降低可能代偿性地引起了GCase蛋白表达的增加。有关文献报道，神经元中加入野生型或者A53T突变的α-突触核蛋白在降低溶酶体中GCase活性的同时增加了GCase的蛋白表达，α-突触核蛋白可抑制GCase在细胞内的运输[31]。既往有研究表明，在SH-SY5Y细胞中，FAC可以诱导α-突触核蛋白表达升高[32-33]，CBE也可以诱导α-突触核蛋白表达升高[34-36]。本实验加入铁后细胞的GCase蛋白表达明显升高，推测可能是细胞内高铁环境诱导了α-突触核蛋白表达升高，升高的α-突触核蛋白抑制了内质网中GCase的合成，使其不能折叠成正常的构象而无法到达高尔基体加工成熟，未加工成熟的蛋白不具备酶的活性，因此GCase蛋白的表达升高，而酶活性降低。本實验中没有观察到FAC与GCase抑制剂两者的协同作用（析因设计方差分析显示，FAC、CBE两种因素之间无交互作用，因此说明FAC与CBE无协同作用）。

綜上所述，在高铁环境下，SH-SY5Y细胞内GCase的活性降低，蛋白的表达升高。本实验结果为进一步深入研究GCase在PD发病中的作用提供了一定的实验依据。

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（本文編辑 马伟平）