邢玉娟，庄彩云，王建国，邱树磊，刘运镇，陈玉库*，杨帆，刘益，曹希敏

(1. 江苏农牧科技职业学院，江苏 泰州 225300；2. 内蒙包头市九原区动物疫病预防控制中心，内蒙古 包头 014060；3. 山东省威海市环翠区动物疫病预防控制中心，山东 威海 264200)

犬细小病毒病是由犬细小病毒(canine parvovirus，CPV)感染引起的一种急性、热性、传染性疾病，临床上以出血性肠炎或非化脓性心肌炎为特征[1]。不同年龄、性别、品种的犬均可感染，病死率高，是危害养犬业的主要疫病之一。目前对于犬细小病毒感染的治疗，对出血性肠炎型病例主要采用紧急注射高免血清或免疫球蛋白、抗病毒、防止继发感染、对症治疗和支持疗法等综合措施，而对非化脓性心肌炎型病例采用上述治疗措施收效甚微[2-3]。为了研制和开发治疗犬细小病毒感染的中药处方，并探讨其抗病毒作用机理，本试验以小鼠为模型观察了中药苦芪超微粉对环磷酰胺致免疫功能低下小鼠脾淋巴细胞增殖率和免疫器官指数变化，在此基础上在犬体内研究了该药对犬细小病毒感染的保护作用，为进一步扩大临床试验提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验药物

苦芪超微粉，由黄芪、苦参、栀子、甘草4味中药按4∶3∶2∶1比例组成，由河南省康星药业股份有限公司试制。使用时用双蒸水配制成500 mg/mL的混悬液。

黄芪多糖口服液，北京生泰尔生物科技有限公司生产，批号1608191。

环磷酰胺注射液，江苏盛迪医药有限公司生产，批号H32020857。

1.2 主要试剂

小牛血清，杭州四季青生物制品厂产品；RPMI 1640培养液，Gibco公司产品；伴刀豆素球蛋白(ConA)，上海浩然生物技术有限公司产品；四甲基偶氮唑蓝(MTT)溶液，Amresco公司产品；淋巴细胞分离液，上海恒信化学试剂有限公司产品；淋巴细胞裂解液，二甲亚砜(DMSO)，分析纯，苏州正兴化工研究院产品；犬细小病毒(CPV)检测板，上海容晖生物科技有限公司生产。

1.3 试验动物

清洁级昆明小鼠60只，体重(18±2)g，购自南京医科大学实验动物中心(许可证号为SCXK(苏)2013-0005)。

田园犬，60只，42～48 日龄，未接种疫苗，CPV 检测板检测呈阴性，委托江苏农牧科技职业学院实验动物房采购，注射左旋咪唑驱虫，隔离饲养观察7 d。

1.4 苦芪超微粉对免疫抑制小鼠脾淋巴细胞转化及免疫器官指数的影响

1.4.1 对ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化的影响

取昆明小鼠60只，随机分为6组，即苦芪超微粉高、中、低剂量组(40，20，10 mL/kg)、药物对照组(黄芪多糖口服液，10 mL/kg)、模型组和空白对照组，每组10 只。1～4组每天灌胃给药1次，模型组和空白对照组灌胃给予与药物对照组等剂量生理盐水。连续5 d后，1～5 组腹腔注射环磷酰胺(40 mg/kg)，空白对照组腹腔注射生理盐水(40 mg/kg)，连续2 d，末次注射给药后，脱颈椎处死小鼠，无菌取脾脏、胸腺，称重。称重后将脾用灭菌生理盐水冲洗3 次，放入含Hank’s液的平皿中剪碎，装入200 目网孔的尼龙网袋中，用弯针头挤压过滤，收集细胞液，加入淋巴细胞分离液，2 000 r/min离心20 min，吸取中间云雾状白细胞层，用Hank’s液洗2 次，用RPMI 1640营养液稀释成1×104个/mL细胞悬液。将脾淋巴细胞悬液按照小鼠灌胃给药的分组加入到96 孔细胞培养板中，每孔100 μL，每组设置8个复孔，4个孔加入ConA(终浓度为0.325 μg/mL)，另外4个孔加同体积的空白培养基。

将96孔细胞培养板置于5% CO2、39.5 ℃培养箱中72 h，每孔加入20 μL MTT液，继续培养4 h后取出，每孔吸出上清液，加入100 μL裂解液，在微量震荡器上混匀使其颜色变澄清，用酶联免疫仪检测570 nm下的A570值，按照以下公式计算A570差值，作为淋巴细胞增殖的指标[4]。ΔA570为ConA 诱导孔A570均值与无 ConA 诱导孔A570均值的差。

1.4.2 对小鼠免疫器官指数的影响

末次注射环磷酰胺给药后，脱颈椎处死小鼠，称取小鼠体重；取胸腺和脾脏，称取湿重，并计算脾指数和胸腺指数。 免疫器官指数=免疫器官重量/体重×100%。

1.5 苦芪超微粉治疗犬细小病毒感染的效果观察

1.5.1 动物分组及处理

利用2只患有犬细小病毒病的犬进行水平感染[5]，将自然发病且 CPV 检测板检测呈阳性的53只病犬随机分为 5组(取其中50只，另外3只另法治疗)，另取3只同日龄饲养的健康犬作为空白对照，隔离饲养。造模后第4 天开始给药。中药给药剂量参考文献[6]，2 kg田园犬(50日龄)给药剂量相当于小鼠的2.46倍。

整个试验过程中，中药治疗组和药物对照组每天每只病犬补充乳酸钠林格注射液500 mL、5%葡萄糖生理盐水250 mL、盐酸消旋山莨菪碱液(654-2)0.5 g、维生素C注射液5 mL、能量合剂10 mL，作为基础治疗，给予清洁而足够的冷淡盐水。见表 1。

表1 动物分组及处理

项目组别空白对照苦芪高剂量苦芪中剂量苦芪低剂量药物对照模型犬数量31010101010给药方案口服生理盐水,每只2 mL,每天2次,连用5 d口服受试药物,每只4 mL,每天2次,连用5 d+基础治疗口服受试药物,每只2 mL,每天2次,连用5 d+基础治疗口服受试药物,每只1 mL,每天2次,连用5 d+基础治疗口服黄芪多糖口服液,每只2 mL,每天2次,连用5 d+基础治疗不给药

1.5.2 观察指标

症状观察：每天观察记录犬的发病情况，包括呕吐、拉稀、精神状态、体温等。

死亡率：每天记录各组死亡数，观察至用药停止后7 d，统计各组死亡率。

治愈率：凡在试验期间，经给药后呕吐、下痢、便血停止，体温、精神状况及食欲恢复正常，治疗结束后观察7 d无异常者，判为治愈，根据治愈犬占整组试验犬比例计算治愈率。

有效率：用药停止后7 d体征大有好转，即体温、精神、食欲恢复正常，但粪便尚未成形，或体温、精神恢复正常，但食欲不振和粪便未成形等，判为有效，根据有效犬占整组试验犬比例计算有效率。

无效率：用药后体征无改善或恶化、死亡者，判为无效。或体温未降至正常，食欲时好时坏，粪便带有血丝或黏液者，判为无效[7]。

1.6 数据处理

数据采用SPSS 17.0软件进行统计学分析，淋巴细胞A570值、免疫器官指数以“平均数±标准差”表示，组间差异比较采用χ2检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 对ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化的影响

与空白对照组相比，模型组小鼠脾淋巴细胞的A570值显著降低(P<0.05)，说明环磷酰胺造模成功；与模型组比较，苦芪超微粉高、中、低剂量组和药物对照组的A570值显著升高(P<0.05)。高剂量组A570值显著高于低剂量组(P<0.05)，中剂量组A570值也高于低剂量组，但差异不显著(P>0.05)。见表2。

表2 苦芪超微粉对脾淋巴细胞增殖的影响

组别剂量/(mL·kg-1)ΔA570值空白对照-0.166±0.022a苦芪超微粉高剂量400.168±0.011a苦芪超微粉中剂量200.162±0.009ab苦芪超微粉低剂量100.149±0.012b药物对照-0.161±0.012ab模型组-0.091±0.023c

注：同列数据肩标不同字母表示差异显著(P<0.05)，相同字母或无字母表示差异不显著(P>0.05)。下同

2.2 对小鼠免疫器官指数的影响

模型组小鼠胸腺指数和脾指数均降低，与空白对照组比较差异显著(P<0.05)，表明造模成功。胸腺指数，与模型组相比，苦芪超微粉高、中、低剂量组和药物对照组有显著差异(P<0.05)；脾指数，与模型组相比，苦芪超微粉高、中剂量组和药物对照组有显著差异(P<0.05)，苦芪超微粉低剂量组脾指数高于模型组，但差异不显著(P>0.05)。见表3。

表3 苦芪超微粉对免疫抑制小鼠脏器指数的影响

组别剂量/(mL·kg-1)胸腺指数脾指数空白对照-2.16±0.57a3.62±0.40a苦芪超微粉高剂量402.09±0.26a3.38±0.34ab苦芪超微粉中剂量202.06±0.41a3.26±0.61ab苦芪超微粉低剂量101.90±0.24a2.94±0.38bc药物对照-2.07±0.20a3.40±0.33ab模型-1.40±0.37b2.53±0.29c

2.3 苦芪超微粉治疗犬细小病毒感染的效果

2.3.1 造模情况

用细小病毒感染犬进行水平感染后，第 1～2天未出现明显症状，第3天起，病犬食欲减退，第 4天出现呕吐与拉稀症状，呕吐物呈白色泡沫状，部分犬伴有腹泻，粪便带有黏液或血丝，气味腥臭，取肛拭子用 CPV 检测板检测为阳性。空白对照组犬只精神状态良好，食欲正常，大小便正常。

2.3.2 各组用药效果观察

苦芪超微粉治疗组试验犬用药3 d后，高剂量组中，呕吐物为白色黏液，虽有拉稀但没有血便出现。用药5 d后，有7只犬呕吐次数减少，排便次数减少，食欲逐渐恢复，用药停止后第3天，呕吐和拉稀均得到控制且食欲恢复，精神良好。另3只犬中，1只犬在用药停止后第7天康复，另2只粪便虽成形、无黏液，但体温稍高，食欲时好时坏，判为无效；中剂量组在用药停止后第7天，8只犬痊愈，另2只病犬食欲尚可，但粪便不成形，体温稍高，判为无效；低剂量组用药5 d后，仍有1只犬有血便，用药停止后第4天，衰竭死亡。其余9只病犬在用药停止后第7天，7只食欲逐渐恢复，另2只粪便较稀软，体温未恢复正常，判为无效。

药物对照组试验犬用药3 d后，有3只犬出现血便。用药5 d后呕吐次数减少，血便次数由3次减少到 2 次。用药停止后第2天，死亡1只，另2只在结束观察前粪便仍带有血丝和黏液，判为无效。见表4。

模型组试验犬在用药停止后第1天有6只排深色血便，呕吐物为白色黏液，被毛粗乱无光泽，精神高度沉郁。用药停止后第3天10只犬均出现血便，呕吐次数由 3～4 次增加到 6～7 次，眼窝凹陷，皮肤弹性减退，精神高度沉郁，卧地不起。用药停止后第4天晚上死亡2只，第5天上午死亡1只，第6天上午死亡1只，第7天上午死亡3只，死亡之前，病犬四肢冰凉，身体蜷缩颤抖，被毛粗乱，体温下降。另3只中，2只在结束观察前仍高度衰竭，濒临死亡，另1只精神好转。见表4。

表4 各组有效率、治愈率和死亡率

组别数量有效数有效率/%治愈数治愈率/%死亡数死亡率/%空白对照3----00苦芪高剂量1088088000苦芪中剂量1088088000苦芪低剂量10770770110药物对照10770770110模型10----770

3 讨论

3.1 苦芪超微粉对淋巴细胞增殖的影响

淋巴细胞增殖是反映机体细胞免疫水平的一个重要指标。淋巴细胞的增殖数量，决定了机体免疫应答的强度[8]。本试验中，苦芪超微粉高、中、低剂量组的A570值显著高于模型组，说明苦芪超微粉能够促进免疫抑制小鼠的脾淋巴细胞的增殖，对环磷酰胺致免疫功能低下小鼠的具有免疫增强作用。高剂量组的效果优于中、低剂量组，提示苦芪超微粉对小鼠特异性免疫功能具有较好的调节作用，且具有一定的量效关系。陈星星等[9]研究用不同浓度的铁皮石斛对环磷酰胺所致免疫抑制模型小鼠脾脏淋巴细胞体外增殖的影响，也取得了相似的结果，在一定浓度范围内，随铁皮石斛浓度的增高，细胞分裂增殖效果有增加趋势。

3.2 苦芪超微粉对机体免疫器官指数的影响

胸腺和脾脏是机体重要的淋巴器官，且胸腺是机体的中枢免疫器官，两者的功能与机体免疫状况密切相关。免疫器官指数是衡量机体免疫状态的初步指标[10]。在本试验中，注射环磷酰胺小鼠的胸腺和脾脏指数均显著低于正常小鼠，灌服苦芪超微粉后提高了免疫抑制小鼠的免疫器官指数，其中高、中剂量组的效果较好，与模型组相比较差异显著，但胸腺指数和脾指数均未能恢复到空白对照组小鼠的水平。提示苦芪超微粉能够在一定程度上逆转环磷酰胺所致的小鼠的免疫器官指数的下降，维持机体非特异性免疫功能。一些研究证明，中药车前草粗多糖能提高环磷酰胺所致免疫低下小鼠血清中溶血素水平，且对脾脏与胸腺萎缩有缓解作用，与本试验的研究结果一致[11-13]。

3.3 苦芪超微粉对犬细小病毒感染的治疗作用

现代研究证明，黄芪主含黄芪多糖、维生素以及多种微量元素等，具有增强免疫和抗病毒作用，苦参主含苦参碱和氧化苦参碱，具有广谱抗病毒作用，栀子主含环烯醚萜类、栀子苷等，具有保肝利胆、抗炎、抗氧化、促进胰腺分泌及胃功能保护等作用[14]。肠炎型犬细小病毒感染，主要表现呕吐、腹泻、便血、脱水、电解质紊乱等症状，治疗时除抗病毒、防止电解质紊乱、补液强心、对症治疗外，仍需防止继发细菌感染。方中黄芪增强免疫，并与苦参协同抗病毒，而栀子等则主要起到抗炎和恢复机体胃肠功能的作用。

根据明代医家吴又可的“杂气”病因学说，犬细小病毒感染属于“毒邪血痢”[15]。治宜补气养血、清热解毒、燥湿止痢。苦芪超微粉由黄芪、苦参和栀子等组成，其中，黄芪性微温味甘，入脾、肺经，功能补气固表，托毒生肌，利水退肿，主治脾肺气虚、表虚汗出、疮痈难溃、水肿；苦参性寒味苦，入心、肝、胃、大肠、膀胱经，功能清热燥湿，祛风杀虫，利尿，主治湿热黄疸、泻痢、疥癣；栀子性寒味苦，入心、肝、肺、胃经，功能清热泻火，凉血解毒，主治目赤肿痛、湿热黄疸、热淋、尿血、衄血[14]。诸药相合，共凑补气养血、清热解毒、燥湿止痢之功。