吴双，柯裕丰，朱善元，吴植，姜勇,2，谢军

(1. 江苏农牧科技职业学院，江苏 泰州 225300；2. 扬州大学兽医学院，江苏 扬州 225009)

新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)是养鸡行业的“头号杀手”之一，也是危害最大的传染病病原之一[1]。NDV具有囊膜，其囊膜表面含有一定数量的血凝素，能够凝集鸡、鸭、鹅、豚鼠和人的“O型血”的红细胞[2]，以及非洲绿猴肾细胞[3]。故可用HA试验检测尿囊液中病毒是否具有血凝性，在HA试验结果基础上可以进行血凝抑制试验，进而明确该养禽场的新城疫抗体水平。HA试验具有操作简便、快速和实用性强等特点，但影响因素较多[4]。涉及1%红细胞悬液的保存时间、抗凝血在4 ℃保存时间、抗原冻融次数、冻融的抗原在4 ℃保存时间、不同稀释液对HA结果的影响，延长1%红细胞悬液的保存时间等问题。为了减少影响因素的干扰，同时也为实际操作提供参考建议，本文对HA试验上述诸多影响因素进行了研究。

1 材料与方法

1.1 生物材料

SPF雏鸡和SPF种蛋均购自浙江立华农业科技有限公司。SPF雏鸡由江苏省兽用生物制药高技术研究重点实验室在禽隔离器饲养至成年；SPF种蛋自行孵化至10日龄。新城疫活疫苗(LaSota)购自青岛易邦生物工程有限公司。

1.2 HA试验操作

参考GB/T 16550-2008 新城疫诊断技术文件，进行HA试验规范操作，在正确使用移液器的前提下，确保抗原倍比稀释的准确性[5-6]，充分混匀后在室温(20～25 ℃)下静置反应，当不加LaSota尿囊液对照孔的红细胞呈明显钮扣状时判读结果，以完全凝集的病毒最大稀释度为该NDV的血凝效价[7-8]。

1.3 NDV LaSota尿囊液的扩繁

NDV疫苗株LaSota稀释104倍接种5枚10日龄SPF鸡胚尿囊腔，0.1 mL/枚，孵育96 h时收获尿囊液，每枚鸡胚的尿囊液单独收获且单独测定其HA效价；选择HA效价最高的尿囊液经稀释106倍后接种5枚10日龄SPF鸡胚尿囊腔，0.1 mL/枚；按照上述操作再鸡胚传代1次。本试验中所用的尿囊液来自同一枚鸡胚，共收获6.0 mL尿囊液，每只指形管分装0.1 mL，共分装60支，保存于-80 ℃冰箱中，使用前室温自然融解[9-10]。

1.4 1%红细胞悬液的制备方法

采血器预先吸取适量的3.8%枸橼酸钠溶液并润湿管壁，按照抗凝剂∶血液=1∶4的比例采集SPF抗凝血。通过翅静脉或心脏途径采集血液，将采集的3份抗凝血混匀后取适量抗凝血置入离心管中，加入3倍至4倍体积的稀释液混匀，分别以2 000 r/min离心3次，第1次5 min，第2次5 min，第3次8 min，弃净血浆和白细胞，最后吸取压积红细胞用稀释液配成体积分数为1%的红细胞悬液，于4 ℃保存备用[11]。

1.5 存放容器种类对抗凝血的影响

按照1.4的操作方法每只鸡采集20 mL抗凝血，3只鸡的抗凝血混匀后分装为15 mL离心管组、100 mL烧杯组、100 mL烧杯+等体积PBS 3组，每组分装4份5 mL抗凝血，分别存放于4 ℃冰箱的同一层中，保存时长为72 h，其中在0、24、48和72 h时每组各取1份抗凝血，按照1.4操作方法制备1%红细胞悬液，同一时间点制备的1%红细胞悬液在同一块血凝反应板中进行HA试验，其中15 mL离心管组和100 mL烧杯组各进行3个重复操作，100 mL烧杯+等体积PBS组进行2个重复操作；上述每个时间点均从-80 ℃取出1份冻存的尿囊液作为抗原；本次试验稀释液选取PBS。

1.6 存放时长对1%红细胞悬液的影响

根据抗凝血在不同容器内放置不同时间，选择对HA效价结果影响最小的容器制备80 mL 1% 红细胞悬液，将其分成4等份，并置于4 ℃冰箱的同一层隔板上，保存时长为72 h。分别于0、24、48、72 h时各取1份进行HA试验，每个时间点进行3个重复操作；每个时间点操作前从-80 ℃取出1份冻存的尿囊液作为抗原，本次试验稀释液选取PBS。

1.7 保存温度和冻融次数对抗原的影响

1.7.1 保存温度对抗原的影响

同时从-80 ℃取出8支NDV LaSota尿囊液，分为室温和4 ℃ 2 组，每组4支尿囊液；每组分别于0、24、48、72 h时各取1支尿囊液进行HA试验。同一时间点尿囊液在同一块血凝反应板中进行HA试验，并进行3个重复操作。本次试验稀释液选取PBS；1%红细胞悬液按照1.4方法新鲜制备。

1.7.2 冻融次数对抗原的影响

从-80 ℃同时取出4支NDV LaSota尿囊液，分别于室温和-80 ℃反复自然解融1、2、3和4次，HA试验前从冰箱取出1支尿囊液和上述4支尿囊液同时进行HA试验，相应的冻融次数依次为1、2、3、4、5次，每份尿囊液进行3个重复操作。本次试验稀释液选取PBS，本次试验使用同一份新鲜制备的1%红细胞悬液。

1.8 稀释液的种类对HA效价的影响

将新鲜采集的60 mL混合抗凝血中，分装于8个100 mL烧杯，5 mL/烧杯，将其分为0.9%氯化钠和PBS 2 组，每组4个烧杯；分别置于冰箱4 ℃的同一层，保存时长为72 h，每组分别0、24、48和72 h各取1份抗凝血制备1%红细胞悬液，1%红细胞的制备以及相应的HA试验均采用同组别的稀释液。每个时间点均从-80 ℃取出1份冻存的尿囊液作为抗原，在同一块血凝反应板中进行HA试验，并进行3个重复。此外为了延长1%红细胞悬液保存时间，采用0.75%氯化钠加2%葡萄糖作为稀释液，研究48 h内HA效价的变化。

2 结果与分析

2.1 存放容器种类对抗凝血的影响

抗凝血在15 mL离心管组中上清逐渐由蜡黄色向淡黄色变化，0 h后红细胞逐渐沉降至离心管底部，白细胞于24 h悬浮于红细胞表面并形成一层白细胞膜，72 h后仍悬浮于红细胞表面。100 mL烧杯组中抗凝血上清清澈透明，0 h后红细胞逐渐沉降至烧杯底部，24 h时白细胞大量悬浮于红细胞表面，48 h后白细胞逐渐消失，72 h后白细胞肉眼不可见，出现少量血凝丝，血凝丝由存放时间的延长而增多。100 mL烧杯+等量PBS组抗凝血上清清澈透明，从0 h开始红细胞逐渐沉降至烧杯底部，24 h白细胞呈点线状少量悬浮于红细胞表面。于每个时间点分别取5 mL抗凝血制备1%红细胞悬液，进行HA试验，结果见表1。

表1 5 mL抗凝血在不同容器内对HA效价的动态变化(log2)

组别0 h24 h48 h72 h96 h120 h15 mL离心管8875--100 mL烧杯888888100 mL烧杯+等体积PBS8876--

注：“-”表示因溶血严重未进行HA试验。

由表1可知，在4 ℃存放条件下，抗凝血存放0和24 h时，3个试验组的抗凝血制备的1%红细胞悬液，测定的同一份抗原HA效价均为8log2；在24 h之后，15 mL离心管组和100 mL烧杯+等量PBS组内的抗凝血所检测的HA效价开始不断下降，72 h后差异显著。3组中100 mL烧杯组的结果是最稳定的。

2.2 存放时长对1%红细胞悬液的影响

1%红细胞悬液在4 ℃保存条件下，于24 h时出现微溶血，48～72 h 1%红细胞悬液溶血情况较24 h严重，相应地48～72 h的血凝反应板检测孔内的红细胞也是呈现出溶血现象，存放时长对1%红细胞悬液的影响的具体结果如图1所示。

图1 1%鸡红细胞悬液于4 ℃存放时HA效价的动态变化

2.3 保存温度对抗原的影响

NDV LaSota尿囊液对温度非常敏感，在室温20～25 ℃条件下，0～24 h、24～48 h间NDV LaSota尿囊液均下降1个滴度，48 h后趋于稳定；NDV LaSota尿囊液在4 ℃条件下，0～72 h均比较稳定(见图2)。

图2 不同保存温度对LaSota尿囊液HA效价的动态影响

2.4 冻融次数对抗原的影响

NDV LaSota尿囊液在-80 ℃保存条件下，每冻融2次，下降1个血凝滴度，结果见图3。

图3 冻融次数对LaSota HA 效价的影响

2.5 稀释液的种类对HA效价的影响

使用稀释液0.9%氯化钠和PBS制备的1%红细胞悬液，在4 ℃存放72 h，其影响HA效价的动态变化如图4所示。PBS 缓冲能力优于0.9% 氯化钠，0.9% 氯化钠组与PBS组相比普遍低1个滴度。HA 试验中所用的稀释液优先选择 PBS。此外，0.75% 氯化钠加2% 葡萄糖作为稀释液，制备1%红细胞悬液并进行 HA 试验发现，此稀释液能够有效延长1% 红细胞悬液的保存时间，在48 h内检测到 LaSota 尿囊液 HA 效价均为9log2。

图4 2种稀释液对HA效价的动态影响

3 讨论

当红细胞处于一种非生理性模式时，在该模式的机械压力或者高温、低温等情况下，红细胞会发生细胞损失，常见的损伤表现为立即或者延迟性“溶血”，也有可能会发生“亚致死性损伤”[12]。溶血会导致红细胞破碎、有效红细胞数量减少、红细胞比容降低，直接影响 NDV 的血凝素与红细胞的有效凝集；同时红细胞渗透脆性值不断增大，随着保存时间的不断延长，红细胞破坏加剧，溶血率显著增加[13]。试验结果表明未稀释的抗凝血存放于较大容器内于4 ℃ 保存的时间更长，液体高度低会减少机械压力，同时促使溶液中含氧量增多，亦有助于维持全血中的血小板数量、充分发挥白细胞吞噬细菌的功能及优化制备细胞悬液等优点[14-15]。因此在不影响试验的情况下1% 红细胞悬液应现配现用。冻融次数是影响 NDV LaSota 尿囊液的关键因素，其冻融次数会严重影响 HA 效价， 建议NDV LaSota尿囊液冻融次数不超过2 次。稀释液对于 HA 效价影响较大，试验结果表明 PBS 的缓冲效果略优于0.9% 的氯化钠溶液。由于哺乳类动物需用生理盐水浓度是0.9%，而禽类需用的生理盐水浓度是0.75%，在后续试验中亦比较了两者的优劣，结果发现0.75% 氯化钠浓度的缓冲效果更佳，与 PBS 效果相当。研究表明适当浓度的氯化钠和葡萄糖不会引起红细胞的溶血[16]。本试验研究亦发现含2% 葡萄糖的0.75% 氯化钠溶液可以维持 HA 效价为9log2 时长达48 h。通过研究发现影响HA试验的因素比较多，除了操作技巧要熟练外，还需选择最优条件进行，这样才能获得更准确可靠的结果。