梅原，薛洋，于昊，姜志洋，申军士，茆达干

(动物科学类国家级实验教学示范中心/南京农业大学动物科技学院，江苏 南京 210095)

蛋白质是反刍动物营养水平的主要限制因素，但富含蛋白质的豆科牧草却不能被广泛的种植，蛋白质饲料又通常非常昂贵，不适合用于大规模饲养生产，设计低蛋白日粮不仅能够有效降低饲料成本，也能减少排泄物中氮对环境的污染。据估计，到2020年我国蛋白饲料缺口将达到4 800万吨，蛋白质饲料资源的缺乏促使人们在生产中寻找新型蛋白质原料，而众多研究表明，非蛋白氮(non-protein nitrogen)饲料原料是反刍动物最直接、有效的蛋白质饲料替代品。

非蛋白氮虽然种类很多，然而能够作为牛羊补充氮源的却很有限。人们目前已对20多种可应用于反刍动物生产的非蛋白氮进行了大量饲用试验，结果显示饲养价值较好的是尿素和双缩脲。普遍采用尿素添加在反刍动物饲料中[1]。将尿素配制成混合料并制成颗粒料时，应占混合料的1%～2%为宜，若含量超过3%，会影响饲料适口性，甚至可能导致中毒。Wang等[2]发现在杜泊杂交羊日粮中添加1.5%尿素对提高绵羊的生长性能是安全有效的。张峰等[3]试验显示，在绵羊日粮精料中添加2%包被尿素添加剂具有增进食欲、提高生长速度、经济效益明显等特点。张娇娇等[4]在肉牛与异地育肥牦牛饲粮中添加 1%的缓释尿素，发现肉牛与牦牛均获得较小的料重比和较高的平均日增重。Ji 等[5]发现缓释尿素作为肉羊浓缩饲料中大豆的替代品不应超过4%，否则较高的剂量可能导致营养不良和矿物质代谢紊乱。Gardinal 等[6]发现，在饲料中添加2%的尿素组较10.6% 粗蛋白(CP)对照组和添加1%尿素组，降低了平均日增重。这些研究表明在反刍动物饲养中合理使用非蛋白氮饲料产品，可以达到节约蛋白饲料资源，降低饲料成本和提高动物生产效率的目的。

目前关于非蛋白氮对反刍动物的影响主要集中在生长性能上，对生殖尤其是睾丸发育的研究还非常有限。徐诣轩等[7]对湖羊的研究发现，血氨和血尿素氮浓度随尿素补充水平的提高而显著升高。而较高的尿素氮和氨浓度可能会损伤精子、卵子和胚胎，改变母羊子宫内的pH值，引起中间代谢改变、血糖、游离脂肪酸浓度变化，影响激素的生物合成，减少促黄体素与其受体的结合，降低了受胎率，导致繁殖力的下降，因此，血液中的尿素氮既反映了能氮平衡问题，更反映了潜在的繁殖力[8]。

湖羊原产于太湖区域，具有许多优良性状如早熟、早期生长快和繁殖力高，因而被广泛引入到全国各地。本试验在前人研究的基础上，通过研究日粮中添加不同水平的尿素对湖羊睾丸发育的影响，以期为非蛋白氮应用于湖羊生产实践提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验设计

将70只3～4月龄、体重接近(24.3±1.7) kg的雄性湖羊(南京三六九养殖专业合作社)随机分为5组，分别饲喂含有豆粕或不同水平尿素的日粮：低蛋白对照组(低蛋白饲粮，CP=11.6%)、高蛋白对照组(豆粕饲粮，CP=17.6%)、1%尿素组(低蛋白饲粮+1%尿素，CP=14.5%)、2%尿素组(低蛋白饲粮+2%尿素，CP=17.3%)、3%尿素组(低蛋白饲粮+3%尿素，CP=20.1%)。每组7个重复，每个重复2只羊。预饲期1 周，正试期8周。试验结束后，采集血样冻存，测量睾丸参数，并将睾丸组织固定。

由于2%尿素组与高蛋白对照组蛋白水平相当，增重效果也相当，因此本试验仅选取高蛋白对照组、低蛋白对照组、1%尿素组、3%尿素组进行采样。

1.2 日粮配方

试验基础日粮参照《肉羊饲养标准 (NY/T 816-2004)》进行配制。各组日粮组成及营养水平见表1。

1.3 测定指标及方法

1.3.1 血清睾酮的测定

应用放射免疫方法检测血清睾酮浓度。由上海信帆生物技术有限公司测试，试剂盒灵敏度为0.02 ng/mL；精密度为批内变异CV<10%，批间变异CV<15%。

1.3.2 睾丸表观参数的测定

用卷尺和钢尺测量睾丸长径、短径、周径；用天平称取睾丸重量；计算睾丸指数，即双侧睾丸重(mg)和体质量(g)的比值。

1.3.3 睾丸组织学观察

将采集好的睾丸组织样品经过固定、脱水、透明、透蜡、包埋和切片制成睾丸组织切片，用苏木素-伊红染色法进行染色。通过虚拟显微镜来观察染色切片，分析睾丸组织的形态变化。根据它们的形状分为精原细胞(SG)，初级精母细胞(PS)，圆形精子细胞(RST)，细长型精子细胞(EST)。

表1 试验日粮配方及营养水平

项目高蛋白对照组低蛋白对照组1%尿素组2%尿素组3%尿素组原料组成/%玉米青贮25.0025.0024.7524.5124.27花生秧20.0020.0019.8019.6119.42玉米29.0042.0041.5841.1840.78豆粕17.004.003.963.923.88麸皮4.004.003.963.923.88预混料5.005.004.954.904.85尿素0.000.001.002.003.00营养水平粗蛋白/%17.611.614.517.320.1中性洗涤纤维/%31.632.733.131.932.8酸性洗涤纤维/%20.720.421.320.820.9粗脂肪/%2.893.083.123.083.17灰分/%9.009.129.129.119.09消化能/(MJ·kg-1)13.613.813.613.513.4

注：每公斤预混料中所含成分：NaCl 150 g，NaHCO3200 g，Ca 75 g，P 20 g，Mn 600 mg，Fe 680 mg，Zn 960 mg，Cu 300 mg，维生素A 140 kU，维生素D3 55 kU，维生素E 700 mg，烟酰胺600 mg。

1.3.4 曲细精管参数测量

用Image Pro Plus软件测量曲细精管生精上皮厚度，每个睾丸组织样本选取4个曲精小管截面测量，仅评估圆形和近圆形小管。通过小管外径减去小管内径来计算生精上皮厚度[9]。

1.4 统计与分析

试验数据采用Excel 2012处理后，使用SPSS 22.0软件进行统计学分析，应用单因素方差分析进行显著性检验。各组的试验数据均用“平均值±标准差”表示。

2 结果与分析

2.1 不同非蛋白氮水平对湖羊睾丸重和睾丸指数的影响

由表2可知，2个对照组的睾丸重和睾丸指数相当。补充1%尿素较低蛋白对照组睾丸重量下降14.89%(P=0.495)，睾丸指数下降18.13%(P=0.32)，差异不显著。补充3%的尿素较低蛋白对照组睾丸指数下降12.34%(P=0.53)，差异不显著。

补充1%尿素较高蛋白对照组睾丸重量下降11.34%(P=0.62)，睾丸指数下降16.25%(P=0.457)，差异不显著。补充3%尿素较对照组睾丸指数下降10.33%(P=0.663)，差异不显著。

2.2 不同非蛋白氮水平对湖羊睾丸长径、短径和周径的影响

由表3可知，各组间睾丸长径和短径差异均无统计学意义(P>0.05)。1%尿素组周径较低蛋白对照组、3%尿素组和高蛋白对照组略有增加。

表2 不同蛋白水平下育成期湖羊睾丸重与睾丸指数

组别睾丸重/g睾丸指数低蛋白对照94.17±28.185.35±1.301%尿素80.83±36.534.38±1.873%尿素86.00±34.354.69±2.07高蛋白对照91.17±33.385.23±1.94

注：同列数据肩标不同字母表示差异显著(P<0.05)，相同字母或无字母表示差异不显著(P>0.05)。下同

表3 不同蛋白水平下育成期湖羊睾丸长径、短径和周径 cm

组别长径短径周径低蛋白对照7.00±1.435.19±0.6111.92±2.161%尿素7.25±1.595.23±0.7912.17±2.253%尿素7.12±1.225.04±0.7411.68±2.26高蛋白对照7.25±1.485.13±0.7211.62±1.88

2.3 不同非蛋白氮水平对湖羊睾丸组织形态的影响

由图1、2看出，低蛋白对照组的生殖细胞层数与其他组相比略少(图1)。进一步观察发现，低蛋白组管腔中细胞分化明显，但胞质内含大小不等的空泡，空腔较大，PS、精子数量少。曲细精管边缘皱缩、不规则(图2A)。1%尿素组SG、PS、精子细胞和少数长形精子细胞从曲细精管基底膜有序向中央排列(图2B)。3%尿素组管壁到管腔排列整齐，细胞分化明显，但只停留在精子细胞阶段，无精子。少量曲细精管萎缩，边缘皱缩、不规则，少量细胞脱落(图2C)。高蛋白对照组管壁到管腔排列整齐，细胞分化明显，有明显的精子细胞，但精子较少。部分曲细精管内生精细胞变性，曲细精管边缘皱缩、不规则，胞质内含大小不等的空泡(图2D)。

A.低蛋白对照组；B. 1%尿素组；C. 3%尿素组；D.高蛋白对照组

图1 不同蛋白水平下育成期湖羊睾丸组织学观察

A.低蛋白对照组；B. 1%尿素组；C. 3%尿素组；D.高蛋白对照组

图2 不同蛋白水平下育成期湖羊睾丸曲精细管观察

2.4 不同非蛋白氮水平对湖羊睾丸曲精细管外径、内径和生精上皮厚度的影响

由表4可知，低蛋白组睾丸曲精细管内径和生精上皮厚度均较1%尿素组、3%尿素组和高蛋白对照组有所下降。补充1%尿素较低蛋白组睾丸内径下降23.31%(P=0.035)。生精上皮厚度上升26.01%(P=0.082)。补充3%的尿素较低蛋白组睾丸内径下降19.59%，(P=0.205)，生精上皮厚度上升16.33%(P=0.343)。高蛋白对照组较低蛋白组内径下降15.57%(P=0.320)，生精上皮厚度上升17.88%，(P=0.410)，差异不显著。说明添加1%尿素可以显著减小睾丸内径，生精上皮厚度有上升趋势，而添加3%尿素对生精上皮厚度发育无显著影响。

表4 不同蛋白水平下育成期湖羊睾丸外径、内径和生精上皮厚度μm

组别外径内径生精上皮厚度低蛋白对照183.36±6.5894.68±13.85a88.69±20.201%尿素184.37±3.3472.61±6.29b111.76±7.103%尿素179.30±8.4176.13±16.08a103.17±11.73高蛋白对照184.46±6.3679.94±19.51a104.52±24.77

2.5 不同非蛋白氮水平对湖羊血清睾酮的影响

血清睾酮浓度低蛋白对照组(1.18±0.99)ng·mL-1与1%尿素组(1.17±0.88)ng·mL-1相当，高蛋白组(1.69±1.06)ng·mL-1与3%尿素组(1.74±1.41)ng·mL-1相当。补充1%尿素较高蛋白对照组睾酮浓度下降30.77%，差异不显著(P=0.292)。补充3%的尿素较低蛋白组睾酮浓度上升47.46%，但差异不显著(P=0.392)。

3 讨论

3.1 日粮非蛋白氮水平对反刍动物性腺发育的影响

研究表明，蛋白质缺乏通过下丘脑或垂体前叶干扰促黄体素和促卵泡素释放影响动物的繁殖机能[10]。Waghorn等[11]的试验结果表明饲喂低蛋白日粮(13.38% CP)会降低母羊排卵率。Butler等[12]曾报道，饲喂高蛋白日粮会增加血浆尿素的浓度，从而干挠孕酮诱发子宫内膜正常的分泌活动，导致异常的子宫微环境。对于雄性反刍动物，日粮蛋白质不足会导致青年公牛生长发育受阻，性腺发育缓慢；成年公牛繁殖机能下降。公羊睾丸大小与生育力密切相关，提高幼畜的营养水平可使其初情期提前到来。罗家宁[13]试验表明，高蛋白饲料(20% CP)可以提高西农萨能种公羊睾丸周径。

本试验不同蛋白水平的日粮(11.6%～20.1% CP)对湖羊睾丸重量影响不大，但含有不同水平(1%，3%)尿素的NPN日粮(14.5% CP，20.1% CP)的睾丸重量略有下降。不同蛋白水平对湖羊睾丸长径、短径和周径影响不大，与罗家宁[13]研究不一致，可能是品种差异所致。

3.2 日粮非蛋白氮水平对反刍动物精子发生影响

李静等[14]试验显示高蛋白(17.99% CP)日粮可显著提高公羊采精量、精子密度和有效精子数。张作仁等[15]试验表明，无论是否在配种期，种公羊的体质和繁殖机能与营养水平均呈正相关，营养成分不平衡或缺少导致生殖器官机能减弱，性欲降低，精子数量减少，活力减弱，畸形精子增加。Guan等[16]研究表明低营养供应(13.97% CP)会降低美利奴公羊射精量，导致精子在冷冻过程中DNA的损伤率增加，降低精子产量和活率。任婉丽等[17]研究表明，日粮不同蛋白质水平(9.19% CP、11.41% CP、12.39% CP)对精液品质有显著的影响，提高日粮蛋白质水平可使辽宁绒山羊种公羊的采精量和精子活力升高，精子畸形率下降，且中蛋白组的精子密度最高。Khalifa等[18]用蛋白质含量丰富的埃及车轴草替代部分精料混合料饲喂公山羊，结果表明，饲喂750 g的埃及车轴草与饲喂500 g相比，精液品质显著提高，精子畸形率显著降低。

虽然蛋白质对于提高公畜繁殖性能有着重要的作用，但也并非是蛋白质水平越高越好。蛋白质水平过高会使动物体内产生大量的有机酸和其他代谢产物，增加了肝肾的负担，从而导致中毒，对动物繁殖性能不利，导致精液的品质下降。方立超等[19]通过对比试验观察到，蛋白质水平过高(24% CP)，对处于性腺发育期的肉仔鸡曲细精管内生精细胞的发育有一定的阻碍作用。有研究表明尽管日粮中提供高蛋白饲料能够提高公畜精液密度，但是高蛋白水平同时也会使精子活力下降，对精子正常形态产生不良影响。当日粮蛋白质过剩时，过量的蛋白质分解成氨基酸通过影响能量的平衡和营养的分配而直接影响动物繁殖[20]。

本试验中低蛋白组(11.6% CP)曲细精管内生精上皮细胞层数和精子数较少，可能是由于其日粮蛋白质水平未达到该阶段湖羊的营养标准(14%～15% CP)，而1%尿素组蛋白水平最接近营养标准，其睾丸切片效果最理想，有明显的精子细胞和精子。3%尿素组与高蛋白组的蛋白质水平都高于营养标准，其曲细精管虽然细胞分化排列整齐，但管内精子较少，这与以上蛋白浓度过高影响繁殖机能的观点基本一致。不同非蛋白氮(1%～3%)水平对湖羊曲细精管生精上皮发育差异并不显著，可能是饲喂时间较短(2个月)，因为通过提高日粮营养水平等方法来提高公畜产生精子的效率和改善精液品质，通常需在饲喂饲料后2至5个月才能表现出来[21]。

3.3 日粮非蛋白氮水平对反刍动物生殖激素的影响

动物饲喂高蛋白质日粮导致机体内氨、尿素及其他含氮化合物上升，造成机体氮不平衡，会加剧能量负平衡程度，影响机体营养分配从而间接影响机体的生殖激素代谢。高产奶牛泌乳期新陈代谢加快，导致机体类固醇代谢加速导致孕酮浓度下降不利于胚胎存活。李红宇等[10]试验研究表明高蛋白质水平(17.8% CP)日粮降低了奶牛黄体功能，黄体在黄体期分泌孕酮能力下降，造成外周血浆中浓度含量降低。雄性动物精子的形成受下丘脑-腺垂体-睾丸轴调节，睾丸间质细胞分泌的睾酮影响雄性生殖器官的发育、刺激生精上皮的发育和精子发生，调节促性腺激素的分泌。本试验中，不同非蛋白氮水平对湖羊血液睾酮浓度影响不大，可能是试验样本数较少，个体差异较大，使差异统计不显著。

4 结论

在育成期湖羊饲料中添加1%～3%尿素对6月龄湖羊睾丸表观参数没有影响，但蛋白日粮过低会影响睾丸精子发生。添加1%尿素对湖羊睾丸精子发生效果最佳。