王旭生，朱欣茹，张朝辉，宋景贵

卒中后抑郁（post-stroke depression，PSD）是卒中后常见的神经精神障碍性并发症，发病率达20%～79%，严重影响患者日常生活能力及神经功能缺损的恢复，使致残率、死亡率升高[1]。目前，PSD的病理生理机制尚未明确，国内外较认可的有两大学说：生物学机制和社会心理学机制[2-3]，其中生物学机制主要包含有炎症因子、神经递质、发病部位等因素。目前已有研究证实炎症因子与卒中相关[4]，但炎症因子是否在PSD发生的过程中发挥作用，相关研究仍较少。本文以PSD大鼠为研究对象，探讨炎症因子IL-17A、IL-1β、TNF-α与PSD的关系。

1 实验材料与方法

1．1 实验动物与模型制备 选取无特定病原体级SD雄性大鼠30只，周龄6～8周，许可证号：SCX（京）2016-0011。按照随机数字表法将30只SD雄性大鼠分为3组：假手术组、卒中组、PSD组，每组各10只，均行蔗糖偏好指数、旷场直线距离测试，作为行为学基线评估，三组间大鼠无差异。

卒中模型制备：卒中组和PSD组大鼠进行左侧大脑中动脉闭塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）缺血90 min再灌注，并于术后24 h进行Longa 5分神经系统评估，选取分值为1～3分的大鼠，作为卒中模型大鼠。

假手术组模型制备：仅用左侧切开手术口，不进行线栓栓塞。

PSD组模型制备：卒中模型造模后孤笼饲养，1周后予慢性轻度刺激（chronic unpredictable mild stress，CUMS），如昼夜颠倒、禁食、禁水、行为限制、夹尾、噪音刺激、潮湿垫料、足底电击等方式，每天给予1～2种刺激，连续4周。抑郁造模成功标准：精神萎靡不振、毛色晦暗、活动度较少、易激惹，蔗糖偏好指数、旷场直线距离明显降低。

1．2 标本处理和指标测定 CUMS刺激4周结束后，对三组大鼠进行蔗糖偏好指数、旷场直线距离测试，评估大鼠快感缺失、运动探索能力等抑郁行为，剔除抑郁造模失败的大鼠。评估结束后将大鼠分别进行新鲜取脑和多聚甲醛灌注，留取外周血，并对新鲜脑进行分区保存。

1．2．1 ELISA法检测外周血IL-17A含量 对外周血进行冰冻离心机离心（3500 r/min，4℃，15 min），将其上清液吸至于一新的EP管中。使用ELISA试剂盒检测上清液中IL-17A含量。

由图3可知，900 ℃煅烧生成的生石灰作为钙质原料时，制备得到硬硅钙石纤维体积密度为90.8 kg/m3； 随着煅烧温度的升高，生成的石灰活性增加，合成了直径更小的硬硅钙石纤维，其体积密度仅为70.4 kg/m3；当温度升至1 100 ℃后，煅烧生成的生石灰活性开始下降，合成的硬硅钙石纤维体积密度逐渐增大，1 200 ℃煅烧生石灰合成的硬硅钙石纤维体积密度增至80.2 kg/m3。由此可见，石灰活性越高，合成的硬硅钙石纤维体积密度越小。

1．2．2 尼氏染色观察左侧海马神经元情况 每组各取3只大鼠进行多聚甲醛外固定，石蜡脱水后进行石蜡切片，并使用尼氏染色液（碧云天）对各组大鼠脑组织切片进行染色，观察各组左侧海马神经元情况。

1．2．3 实时荧光定量PCR检测海马IL-1β、TNF-α的mRNA相对表达水平 取各组剩余大鼠左侧海马并加入1 mL Trizol试剂进行研磨和裂解，提取海马RNA，逆转录成cDNA。以逆转录产物cDNA为模板进行PCR扩增。PCR反应总体积为20 μL，含cDNA模板2 μL，上、下游引物各1 μL，SYBR Green 10 μL，无酶水6 μL。PCR反应在PCR仪上进行，GAPDH作为内参（表1）。软件分析Ct值及相对值（relative quantity，RQ），RQ=2-ΔΔCt，计算炎症因子IL-1β、TNF-α的mRNA相对表达水平。

1．3 统计学方法 应用SPSS 22．0统计学软件进分析，符合正态分布的计量资料采用进行表示，多组间差异检验采用单因素方差分析（ANOVA），两组间差异应用t检验，以P＜0．05表示为差异有统计学意义。

表1 实时荧光定量PCR引物序列

表2 各组大鼠IL-1β和TNF-α mRNA基因相对表达结果

图1 光镜下（400×）各组大鼠左侧海马神经元图片

2 结果

造模期间假手术组大鼠无死亡，卒中组死亡1只，PSD组死亡2只，最终假手术组大鼠10只，卒中组9只，PSD组8只。

2．1 外周血IL-17A水平 假手术组、卒中组和PSD组大鼠血清IL-17A水平分别为18．56±2．56 pg/mL、40．78±4．13 pg/mL和52．10±5．22 pg/mL，整体差异有统计学意义（F=132．638，P＜0．001）；进一步两两比较显示，卒中组（P＜0．001）和PSD组（P＜0．001）均高于假手术组；PSD组高于卒中组（P=0．002）。

2．2 左侧海马IL-1β和TNF-α mRNA基因相对表达水平 3组大鼠左侧海马中IL-1β和TNF-α mRNA基因相对表达水平相比差异均具有统计学意义（P均＜0．001）。进一步两两对比结果发现，IL-1β mRNA基因相对表达水平：卒中组（P＜0．001）和PSD组（P＜0．001）均高于假手术组；PSD组高于卒中组（P=0．002）。TNF-α mRNA基因相对表达水平：卒中组（P=0．028）和PSD组（P=0．003）均高于假手术组；PSD组高于卒中组（P=0．041）（表2）。

2．3 尼氏染色结果 光镜下观察到假手术组的神经元形态饱满，细胞壁完整，数量多而密集；卒中组和PSD组的神经元形态结构异常，神经元染色较浅，部分发生萎缩变形；PSD组与卒中组比较，基质更为疏松，尼氏小体明显减少（图1）。

3 讨论

IL-17A是由CD4+ T细胞亚群Th17细胞分泌的一种炎性因子，其可促进小胶质细胞、巨噬细胞等合成并释放MMP-3、MMP-9等多种毒性物质，还可促进TNF-α的合成和释放[12]。Liu等[13]对小鼠行MCAO，发现IL-17A水平增加会加重脑组织缺血缺氧损伤，认为IL-17A过度表达通过Src-PP2B-mTOR途径加重卒中神经元损伤，抑制IL-17A可能对缺血性卒中有潜在的治疗作用。González-Parra等[14]在对银屑病小鼠的抑郁行为中发现IL-17A高表达，研究后发现IL-17A水平增高通过NFkB和p38MAPK信号通路参与小鼠抑郁的发生。在对抑郁症研究中发现血清IL-17A水平增加和神经递质改变有关，但抑郁症严重程度与血液中IL-17A水平之间缺乏一致的相关性，这表明在应激反应中Th17细胞参与抑郁发生，但可能并不完全依赖于IL-17A[15]。上述研究表明IL-17A在卒中和抑郁中均有高表达，但作用通路不同。在本实验过程中发现，卒中组大鼠、PSD组大鼠的外周血IL-17A含量与假手术组大鼠相比升高，考虑与卒中后缺血缺氧引发细胞因子改变有关，本实验中大鼠脑缺血后以IL-1β和TNF-α等为代表的多种炎性介质失控、释放而形成“瀑布效应”，引起神经细胞变性、坏死、凋亡等，其中IL-17A出现异常表达水平升高。PSD组大鼠的IL-17A含量与卒中组相比升高，差异有统计学意义，考虑PSD组大鼠IL-17A升高不仅与卒中有关，也与大鼠抑郁症状有关。PSD组大鼠在卒中和抑郁双重作用下，IL-17A水平最高，推测IL-17A在卒中和抑郁的发生过程中发挥了作用。

海马主要参与调节情绪、学习记忆和认知功能，对缺血非常敏感，在对卒中小鼠研究中发现海马内含有大量的糖皮质激素受体（glucocorticoid receptor，GR），在应激反应下皮质醇与GR结合可损伤海马进而产生认知功能障碍、情绪低下、失眠等症状[16]。研究表明缺血性卒中后受到CUMS可以引起HPA轴亢进和促炎性细胞因子的水平升高，从而抑制海马的神经元再生，降低脑神经可塑性最终导致PSD的发生[17]。在本研究中，不同组别大鼠左侧海马区的IL-1β、TNF-α mRNA相对表达量不同，其中卒中组高于假手术组，相比差异有统计学意义，考虑卒中后海马缺血缺氧，大量炎症因子参与，其中IL-1β、TNF-α表达较假手术组明显升高。PSD组的IL-1β、TNF-α表达升高最明显，与假手术组、卒中组比较差异均有统计学意义，说明除了卒中所致炎症因子IL-1β、TNF-α表达升高外，CUMS也可能引起HPA轴亢进、炎症因子升高，大鼠逐渐出现抑郁行为，推测大鼠海马IL-1β、TNF-α高表达在卒中和抑郁的发生过程中发挥了作用。

脑组织中大脑皮质、海马CA1区神经元对缺血缺氧最为敏感[18]。方小霞等[19]经研究认为IL-17A缺陷可减轻T1DM小鼠海马小胶质细胞激活促发的神经炎症，进一步减少神经元凋亡。本实验中各组大鼠脑组织切片后行尼氏染色，光镜下假手术组大鼠海马CA1区尼氏染色示神经元细胞形态完整，排列整齐紧密，尼氏体丰富。卒中组大鼠CA1区的神经元细胞相对饱满，但神经元细胞数目减少，形态结构异常，总体排列不致密，且不整齐，基质疏松、尼氏小体减少，说明有神经元损害，但神经元损害相对较轻，与卒中因素有关。PSD组较卒中组神经元细胞数目减少、形态结构异常、染色浅程度加重，大部分发生萎缩变形，尼氏体减少、基质疏松，说明PSD组损伤最重，卒中及致抑郁因素均参与了海马CA1区损伤。

本研究显示，PSD组大鼠血清IL-17A水平、海马IL-1β和TNF-α mRNA基因相对表达升高，PSD的发生可能与炎症因子有关系，为进一步探讨炎症反应在PSD发病机制中的作用提供了一定的理论依据。本实验仍存在不足：仅对IL-17A和海马IL-1β、TNF-α mRNA与卒中和PSD的关系进行研究，并未涉及其他相关影响因素，后续的实验将完善这些研究。

【点睛】卒中后抑郁大鼠血清IL-17A水平上调，海马IL-1β、TNF-α mRNA高表达，卒中后抑郁发病机制中可能有炎症因子参与。