张宇 杨帆

随着社会进步与人们生活水平提高，心血管疾病的发病率日趋增高并逐步年轻化[1]，心血管疾病研究一直是科研工作者不断探索及关注的领域。在分子医学及细胞生物学快速发展的今天，乳鼠心肌细胞是目前心血管疾病研究与治疗的主要对象，乳鼠心肌细胞原代培养则是进行心血管疾病研究的最基础手段[2]。动物体内环境复杂，不利于进行细胞信号转导通路、基因表达及细胞生理病理学特性等研究，故需要稳定、有效的体外细胞培养模 型[3]。心肌细胞具有培养简易方便，且实验重复性好等优点，被认为是进行心脏基因测序及细胞学研究的有效对象，从而推进心脏疾病的治疗进程[4]。成熟心肌细胞分离培养难度较大，并且由于每个实验室体外细胞培养的条件与方法不一致[5，6]，导致原代培养的心肌细胞的存活率、纯度等有很大差异，不仅浪费人力物力，而且导致实验数据不稳定与差异性大等问题，无法满足实验需求，影响实验结果的准确性和可比性。本研究在传统乳鼠心肌细胞原代分离、培养技术基础上进行改良，使乳鼠心肌细胞能够成片状生长，有利于心肌细胞生理、病理及毒理等的基础实验研究进展。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 出生24h 内的C57BL/6J 乳小鼠30只，由贵州医科大学实验动物中心提供。

1.1.2 实验设备 生物安全柜（新加坡ESCO 公司），恒温培养振荡器（美国Thermo 公司），CO2恒温细胞培养箱（美国Thermo 公司），倒置相差光学显微镜（德国Leica 公司），倒置荧光显微镜（德国Leica 公司）。

1.1.3 实验试剂 Dulbecco's Modified Eagle's Medium （DMEM）高糖型培养基（美国Corning 公司），胎牛血清（FBS，以色列BI 公司），5-溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU，美国Sigma 公司），明胶（美国Sigma 公司），0.25%胰蛋白酶（简称胰酶，杭州吉诺生物公司），Ⅱ型胶原酶（美国Thermo 公司），青霉素-链霉素溶液（简称双抗，杭州吉诺生物公司），Troponin I 兔多克隆抗体（美国Abcam 公司），Dylight488 标记羊抗兔IgG（美国Abcam 公司），TrionX-100（上海碧云天公司），牛血清白蛋白（BSA，美国AMRESCO公司），台盼蓝（北京索莱宝公司），无水乙醇（上海沪试），甲醛（上海沪试），磷酸盐缓冲液（PBS，杭州吉诺生物公司）。

1.2 试剂配制

1.2.1 培养基A 含体积分数为10% FBS 及1%双抗配制的DMEM 高糖型培养基。

1.2.2 培养基B 含体积分数为10% FBS、1%双抗以及0.1mmol/L BrdU 配制的DMEM 高糖型培养基。

1.2.3 消化液 将0.1%胰酶与0.1%胶原酶Ⅱ型混匀，现用现配。

1.3 细胞培养方法

1.3.1 取材 乳小鼠置于75%乙醇中消毒后，移入超净工作台，固定其四肢，用无菌眼科剪开胸并取出心脏，剪去心房及结缔组织部分，仅留取左心室，放入预冷PBS 中反复清洗血液，并移入另一无菌玻璃皿中，将心室组织剪为1mm3组织块，在冰上进行上述操作。

1.3.2 细胞消化 第一次消化心室组织：将剪碎后的心室组织移入50ml 离心管，加入10ml 消化液，放入37℃摇床100rpm，15min，弃掉上清，收集沉淀。第二次消化心室组织：将第一次消化后沉淀的心室组织中加入10ml 消化液，37℃摇床100rpm，10min，充分吹打后静止，待未消化完全细胞沉淀后小心收集上清（避免吸入组织块）置于20ml 培养液中。重复5～6次消化步骤，至完全消化为止，收集上清。用200μm筛网过滤，1 000rpm，4℃，离心8min，收集上清。

1.3.3 细胞培养 用培养基A 将收集到的细胞悬液再次重悬，接种于T25 培养瓶，放入5% CO2恒温（37℃）细胞培养箱培养1.5h（即差速贴壁分离法）。将T25 培养瓶中的上清液转移至另一无菌T25 培养瓶，放入细胞培养箱培养1h，进行第二次差速贴壁。同时，在六孔板中铺0.5%明胶，置于培养箱中培养1h 备用。收集上清并计数后，离心1 000rpm，4℃，8min，弃上清，留取细胞沉淀。用培养基B 重悬细胞沉淀，按照1.5×105/10cm2的细胞密度接种于包被0.5%明胶的六孔板中，放入细胞培养箱。同时，取200μl 未接种的细胞悬液进行细胞存活率检测。细胞培养24h 后给予培养基B 换液，前3 天每天使用培养基B 换液培养，以后使用培养基A（即不加BrdU）常规培养。

1.4 细胞形态学观察、细胞纯度及存活率检测

1.4.1 光学显微镜 细胞培养24h 后，于倒置相差光学显微镜下观察。

1.4.2 细胞免疫荧光染色及细胞纯度鉴定 实验前1d 将细胞消化后按照1.5×105/10cm2的细胞密度重新铺于24 孔板中培养24h。次日，拿出细胞吸出培养基，用预冷PBS 轻柔清洗细胞3 次。用4%甲醛溶液固定10min，预冷PBS 轻柔清洗细胞3 次；用0.2% TritonX-100 破膜10min，预冷PBS 轻柔清洗细胞3 次。3% BSA 室温封闭1h，预冷PBS 轻柔清洗细胞3 次。加入Troponin I 兔多克隆抗体（一抗浓度1∶400），放入细胞培养箱孵育16～20h。次日，吸出一抗，预冷PBS 轻柔清洗细胞3 次，加入Dylight488 标记羊抗兔IgG 抗体（二抗浓度1∶400），室温孵育1h，预冷PBS 轻柔清洗细胞3 次，在倒置荧光显微镜下观察。细胞纯度=荧光染色阳性细胞数/细胞总数×100%。

1.4.3 细胞存活率检测 利用台盼蓝染色法评价细胞存活率，是目前常规的检测方法。留取200μl 细胞悬液，加入等量0.4%台盼蓝染液，室温染色2～ 3min。将染色后的细胞悬液涂于载玻片上，盖玻片封片，于倒置相差光学显微镜下观察。任意选取5个视野，统计被染色细胞（死细胞）和未被染色细胞（活细胞）。细胞存活率（%）=未被染色细胞/（被染色细胞+未被染色细胞）×100%。

2 结果

2.1 细胞形态学观察及细胞纯度检测

2.1.1 光学显微镜 细胞培养24h 后，心肌细胞基本全部贴壁，伸出伪足，呈梭形、三角形或不规则形，核仁清楚（图1A）。培养48h 后，细胞伪足逐渐增多，呈局部片状。培养72h 后，大部分心肌细胞的突起相互交联，形成片状（图1B）。

图1 乳小鼠原代培养的心肌细胞图

2.1.2 细胞免疫荧光染色 培养24h 和培养72h 后，通过免疫荧光染色检测贴壁心肌细胞，细胞呈梭形、三角形或不规则形。培养24h 后，细胞呈簇状或团状分布（图2A）；培养72h 后，细胞已相互连接，形成片状（图2B）。随机选取5 个不同镜下视野计算出心肌细胞纯度为（95.30±1.36）%。

图2 乳小鼠原代培养的心肌细胞荧光染色图

2.2 细胞搏动频率在倒置显微镜下观察，细胞培养24h 后有少数自发性搏动；培养48h 后出现局部片状搏动，节律、频率不等，收缩频率为（99.33±5.13）次/min；培养第5 天，大部分心肌细胞呈同步收缩，收缩频率为（100.67±6.43）次/min；培养第7 天、第9 天、第11 天，细胞仍保持均一搏动，收缩频率分别为（104±10）次/min、（92.67±10.02）次/min、（97.00±9.17）次/min（图3）。

2.3 细胞存活率通过台盼蓝染色法我们检测出在培养第2 天、第5 天、第7 天、第9 天、第11 天的细胞存活率分别为（95.33±2.51）%、（83.00±3.60）%、（63.33±3.51）%、（57.67±3.06）%、（48.67±3.21）%（图4）。

图3 乳小鼠原代培养心肌细胞搏动频率

图4 乳小鼠原代培养心肌细胞存活率

3 讨论

心血管疾病的基础研究技术历经50年的发展，现今的电生理、钙瞬变、蛋白质组学及基因水平转移等研究，对探索心肌细胞病理生理状态的功能改变起到至关重要的推进作用[7]。心肌细胞的分离与培养则是深入研究心血管疾病最基础的手段[2]。体外培养的心肌细胞去除了体内复杂的体液、神经等因素的作用，尤其相较于心肌细胞株H9C2 更能有效反映心脏生理特性、信号传导通路及基因表达等，是研究心血管生理、病理、毒理的常用细胞模型[4]。心肌细胞对物理、化学等损伤极为敏感，这将导致体外分离培养的心肌细胞产量和存活率低等问题。此外，心肌细胞占心脏组织的25%，其余心脏成分以成纤维细胞为主[8]，成纤维细胞分裂增殖能力强，更能成为体外培养的优势细胞。因此，为了在体外培养出纯度高、活性强的心肌细胞，我们根据实验研究经验，在传统的实验技术方法上进行 改良。

在小鼠年龄选择上，传统的心肌细胞培养选用出生3 天的乳鼠[5]，认为此时的心肌细胞增殖更快，但是由于出生时间短的小鼠心脏组织中胶原组织含量少，细胞消化过程省时省力，并且能减少对心肌细胞的损害，因此，我们选用出生24h 内的小鼠进行实验。在实验操作的时间节点选择上，传统的实验方法是差速贴壁1 次，时间为1.5h[2，8]，但是我们发现，在第1 次差速贴壁后的上清液中仍有大量成纤维细胞，由于心肌细胞的贴壁时间为4～24h，因此，我们将第1 次差速贴壁后收集的上清液进行第二次差速贴壁，时间为1h。在培养细胞接种密度上，细胞接种密度对细胞正常生长也同样重要，细胞过密导致营养不良，细胞过疏也将降低细胞间信号传递，由于大多数实验室暂无标准化的细胞接种密度，我们根据William 等[9]的研究，推荐使用1.5×105/10cm2的细胞密度进行接种。我们所分离培养的心肌细胞在搏动节律上一致，搏动频率在培养第2～11天无明显差异。通过以上三点的改进，我们在体外分离培养的心肌细胞存活率在培养第2 天达（95.33±2.51）%，在培养第11 天达（48.67±3.21）%，是前面的研究所没有观察到的[8，10]。

综上所述，我们在短时间内体外分离培养获得纯度高、存活率高、生长状态良好的成片状的原代心肌细胞，有利于今后为心血管疾病的基础研究提供参考。