骆 凡,陈 杰 ,袁 捷,韩祖成,刘冬玲 ,赵 媛 ,王 辉

1.陕西中医药大学(咸阳 712046)；2.陕西省中医医院(西安 710003)；3.西安市中医医院(西安 710021)

2019年12月底武汉出现多起不明原因发热、咳嗽、气促、呼吸困难、肺部感染，严重者可有急性呼吸窘迫综合征、多器官衰竭、死亡，其主要传播途径为呼吸道传播，随着疾病的蔓延，我国其他省市也相继发现此类病例[1-2]。经基因检测为β-冠状病毒属(β-coronavirus)病毒，是一种新型冠状病毒，世界卫生组织(WHO)为其命名为新型冠状病毒肺炎。此病潜伏期长、传染性强、人群普遍易感，目前治疗上主要以抗病毒治疗及对症支持治疗，尚无特效药，对国民健康、经济和社会带来极大的不良影响。

中医药在SARS病毒肺炎、H1N1流感防治期间发挥了重要作用[3-4]。此次疫情发生以来国家卫健委数次更新的《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案》(国家方案)都将中医诊疗置于不可或缺的地位。新型冠状病毒肺炎(COVID-19)为国家乙类传染病范围，属中医“疫病”、“瘟疫”范畴[5]。吴又可在《瘟疫论》中提及“疫者，感天地之戾气”。其主要病位在肺，疫毒闭肺，则有发热、咳嗽，或有黄痰、胸闷气促、咳嗽憋喘、动则气喘，根据辨证论治及国家方案中医诊治方案予以麻杏石甘汤加减治疗。麻杏石甘汤为张仲景《伤寒论》中治疗肺热咳喘的经方，赵淑萍[6]在82例急性肺炎研究中，发现中药麻杏石甘汤对于急性肺炎具有很好的治疗效果。研究表明麻杏石甘汤临床疗效明显，但其作用机制大多不详。对于中药的多成分、多通路协同作用，网络药理学能提供较好的研究方向。

网络药理学将系统生物学、药理学、计算机辅助药物设计、生物信息学等学科相结合,采用“药物-靶点-疾病”相互作用网络,是对中医学整体观念、辨证论治、系统论的具体阐释。因此针对麻杏石甘汤治疗新型冠状病毒肺炎的机理及机制,本研究采用网络药理学研究方法,对麻杏石甘汤的作用物质基础及机理机制进行挖掘,为麻杏石甘汤治疗新型冠状病毒肺炎作用机制的科学内涵提供参考。

材料与方法

1 药物活性成分筛选 查询中药系统药理学数据库与分析平台(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php，设置口服生物利用度(OB)≥30%、类药性(DL)≥0.18)、中国天然产物化学成分库(http://pharmdata.ncmi.cn/cnpc)、BATMAN-TCM数据库(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm，设置Score cutoff 为20，P<0.05)；搜索关键词“麻黄、杏仁、石膏、甘草” “MA HUANG、XING REN、SHI GAO、GAN CAO”，获得其活性成分信息,并将相关资料导出Excel表格。

2 药物作用靶点预测 将筛选出的麻黄、杏仁、石膏、甘草生物活性成分对应的靶点通过Uniprot 数据库(https://www.uniprot.org)UniprotKB检索功能对各靶点人类基因简称进行查询，获得麻杏石甘汤可能存在的靶点。

3 疾病靶点查询 使用OMIM数据库(http://www.omim.org)、TTD(http://bidd.nus.edu.sg/group/cjttd)、DrugBank(https://www.drugbank.ca)、GeneCards(http://www.genecards.org)数据库，以“COVID-19、2019-nCoV、novel coronavirus pneumonia”为关键词在OMIM数据库、TTD、DrugBank、GeneCards数据库进行搜索，以新型冠状病毒防治指南中推荐药及当前热门研究抗新型冠状病毒药物“瑞德西韦(Remdesivir)、磷酸氯喹(Chloroquine)、拉匹拉韦(Lapilavir)、洛匹那韦(Lopinavir)、利托那韦(Ritonavir)”等在DrugBank数据库中查询，获得新型冠状病毒肺炎(COVID-19)疾病过程中已知的靶点。

4 成分-靶点网络构建 通过文恩图(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn)将麻黄、杏仁、石膏、甘草等活性成分靶点与新型冠状病毒肺炎靶点取交集，得到麻杏石甘汤与新型冠状病毒肺炎相关的靶点。使用Cytoscape 3.7.1 构建麻杏石甘汤主要化学成分-对应靶点网络图。

5 靶点相互作用网络构建 将取交集后的靶点导入在线系统String 11.0(http://string-db.org)，获得靶点相互作用网络图(PPI)。该系统对参与作用的靶点进行打分，分值越高表明相互作用关系越密切。

6 生物通路分析 使用基因注释工具DAVID数据库(https://david.ncifcrf.gov)对PPI 网络中的关键靶点进行生物通路富集分析，分析麻杏石甘汤治疗新型冠状病毒肺炎主要参与的生物通路，探讨麻杏石甘汤治疗新型冠状病毒肺炎可能的作用机制。

结 果

1 麻杏石甘汤活性成分及相应靶点 见表1。初步检索得到已知的麻黄活性成分132种，如麻黄素、麻黄碱、去甲基麻黄碱、毛果碱、伪麻黄碱、乙酸薄荷酯、亚油酸、芹菜素等活性成分，预测靶点1272个；杏仁活性成分27种，如苦杏仁苷、棕榈酮、玉红黄素、异松油烯、醋酸萜品酯、乙酸芳樟酯、芳樟醇、柠檬烯、花生酸、柠檬醛等，预测靶点466个；石膏主要成分为硫酸钙等；甘草主要活性成分125种，如甘草四酸、甘草次酸、异补骨脂酮、亚油酸甲酯、异莲心碱、异热马酮、二甲基癸二酸酯、异三叶素、诺维定、甲基乙二醛等，预测靶点690个。

2 药物靶点预测 对279个生物活性成分进行靶点预测，共获得1417个靶点。使用Cytoscape 3.7.1对1417个靶点进行整理，构建成分-靶点网络图(图1)。其中内侧红色图形表示麻黄、杏仁、石膏、甘草活性成分；外侧蓝色图形中的表示该活性成分靶点。

表1 麻杏石甘汤中所含活性化合物基本信息

图1 麻黄、杏仁、石膏、甘草-靶点网络图

3 疾病靶点预测 查询OMIM数据库、TTD、GeneCards、DrugBank共得到新型冠状病毒肺炎相关靶点49个。

4 中药化合物-疾病共有靶点 通过韦恩图取交集得到麻杏石甘汤与新型冠状病毒肺炎的共同靶点24个。SUMO1、GSTA2、CRP、TNF、SMAD7、VCP、VCP、IL-13、CCL2、ADA、IL-6、ACE、PML、RNASE3、SOD1、CREB1、IL-4、ATF2、G6PD、NOS3、TP53、TLR9、IL-1B、ALB、NR1I2。以上靶点经Uniprot数据库规范名称后，靶点信息及Uniprot编码等详细信息见表2。

表2 基因蛋白详细信息

5 蛋白质相互作用网络图(PPI) 见图2。

图2 蛋白质互相作用网络图

将上述作用蛋白导入String 数据库,限定物种为人,获取蛋白之间相互作用关系,保存其TSV 格式文件,导入Cytoscape 软件绘制相互作用网络,图中节点表示靶点,边表示靶点之间的关联,共涉及24个节点,222个边。使用Cytoscape 3.7.1 软件进行整理分析，可更清楚地反映麻杏石甘汤治疗新型冠状病毒肺炎的作用机制。进一步分析发现，度>均值(9.25)关键靶点有11个，靶点IL-6、ALB在整个网络中作用较大(度均为18)，其他前几位分别为TP53(度为17)、TNF(度为16)、IL-1B(度为14)、CCL2(度为13)、CRP(度为13)、IL-4(度为12)、CREB1(度为11)、NOS3(度为11)、SOD1(度为10)等。

6 生物通路富集分析 预测靶点的GO富集分析结果如下(图3～6)。

图3 预测靶点的KEGG富集分析生物通路前10

本研究将麻杏石甘汤治疗新型冠状病毒肺炎的PPI网络筛选出的24个重要靶点进行富集分析，获得重要靶点参与的生物过程及通路通过KEGG富集分析共得到34条通络，可以看出，麻杏石甘汤治疗新型冠状病毒肺炎的关键靶点主要参与美洲锥虫病通路、TNF信号通路、麻疹风疹通路、疟疾通路、乙型肝炎通路、炎症性肠病通路、PI3K-Akt信号通路、单纯疱疹病毒感染、甲型流感通路、人类嗜T淋巴细胞病毒Ⅰ型(HTLV-Ⅰ)感染通路、哮喘通路、肺结核通路、toll样受体信号通路、Jak-STAT信号通路、cGMP-PKG信号通路等重要通路。通过GO富集分析可以看出，在分子生物学功能中，主要参与细胞因子受体结合、受体结合、细胞因子活性、生长因子受体结合、酶结合等；在细胞组分中，以细胞外为主；在生物学过程中，主要有调节运输、调节分泌物分泌、炎症应答、免疫效应的过程、凋亡过程负调控、细胞死亡的负调控过程等；进一步说明麻杏石甘汤治疗新型冠状病毒肺炎存在复杂的多靶点、多通路机制和过程。

讨 论

麻杏石甘汤组成为麻黄、杏仁、石膏、甘草，治以辛凉宣泄，清肺平喘。方中麻黄性温为君，以宣肺而泄邪热；搭配辛甘大寒之石膏为臣，而且倍于麻黄，使宣肺而不助热，清肺而不留邪；杏仁味苦为佐，降利肺气，助麻黄、石膏清肺平喘；甘草调和寒温，为佐使药。现代医学研究表明方中麻黄所含麻黄素属于苯丙胺类兴奋剂，为拟肾上腺素药，有收缩血管、舒缓平滑肌、加速新陈代谢的作用，在治疗哮喘、感冒等疾病时广泛应用[7]。麻黄碱和伪麻黄碱二者互为立体异构体。麻黄碱主要以复杂机制作用于各型肾上腺素受体，发挥对机体多个系统、器官、组织的作用[8-9]。伪麻黄碱的作用方式多以间接作用为主,临床上主要作为抗感冒药的成分。刘赜等[10]从细胞受体、离体器官以及整体动物水平上探讨麻黄碱与伪麻黄碱在平喘作用效果与机制方面的差异，结果表明草麻黄提取物含有麻黄碱及伪麻黄碱,麻黄碱在平喘效果上优于伪麻黄碱,并且草麻黄中麻黄碱含量高于伪麻黄碱,草麻黄中主要由麻黄碱起到平喘作用,伪麻黄碱具有辅助的作用。杏仁主要成分苦杏仁苷具有抗炎[11-12]、抗肿瘤[13]、免疫调节[14]、抗肺纤损伤[15]等多种药理作用。苦杏仁苷类成分口服后，可在下消化道分解后产生少量氨基酸，可以抑制咳嗽中枢而起到止咳平喘的作用。其主要是通过抑制支气管平滑肌细胞、抑制呼吸中枢与β2肾上腺素受体结合等机制[16]。甘草中主要成分甘草次酸是传统中药甘草中天然产物甘草酸的三萜苷元成分，具有多种药理作用，包括抗炎[17]、抗病毒[18]、保肝[19]和抗肿瘤[20]等。研究表明以上成分可能参与麻杏石甘汤抗炎、改善呼吸道症状、抗病毒、调节免疫力等作用，为其治疗新型冠状病毒肺炎提供依据。

麻杏石甘汤中各种活性成分间存在着密切的协同关系，其主要的靶点也在抗新型冠状病毒肺炎中发挥着至关重要的作用。为进一步对麻杏石甘汤治疗新型冠状病毒肺炎的作用机制进行分析，将二者关系进行蛋白质相互作用网络图构建(PPI)与生物通路富集分析。蛋白质之间相互作用PPI网络图是由数据分析每个蛋白质彼此之间的相互作用，以明确各蛋白质、靶点之间的相互联系及相互关系网络图。从筛选后的蛋白质相互作用PPI网络中得到TP53、TNF、IL-1B、CCL2、CRP、IL-4、CREB1、NOS3、SOD1等重要靶点。通过GO富集分析可以看出，在分子生物学功能中，主要参与细胞因子受体结合、受体结合、细胞因子活性、生长因子受体结合、酶结合等；在细胞组分中，以细胞外为主；在生物学过程中，主要有调节运输、调节分泌物分泌、炎症应答、免疫效应的过程、凋亡过程负调控、细胞死亡的负调控过程等；通过KEGG富集分析共得到34条通路，美洲锥虫病通路、TNF信号通路、麻疹风疹通路、疟疾通路、乙型肝炎通路、炎症性肠病通路、PI3K-Akt信号通路、单纯疱疹病毒感染、甲型流感通路、人类嗜T淋巴细胞病毒Ⅰ型(HTLV-Ⅰ)感染通路、哮喘通路、肺结核通路、toll样受体信号通路、Jak-STAT信号通路、cGMP-PKG信号通路等重要通路。新型冠状病毒肺炎主要为新型冠状病毒感染，而麻杏石甘汤亦可发挥抗病毒作用，根据目前已知通路，可能参与甲型流感通路、人类嗜T淋巴细胞病毒Ⅰ型(HTLV-Ⅰ)感染通路、麻疹风疹通路、单纯疱疹病毒感染、乙型肝炎通路等；新型冠状病毒肺炎主要临床表现为呼吸系统症状，而麻杏石甘汤可以通过哮喘通路、肺结核通路等发挥抗肺损伤作用；IL-6、TNF、TLR9可参与toll样受体信号通路，富集分析显示麻杏石甘汤治疗新型冠状病毒肺炎主要参与抗病毒、抗炎、调节免疫、抗疟、抗肺损伤等通路发挥作用。

综上所述，本研究应用网络药理学的技术与方法，对麻杏石甘汤的多成分、多靶点间复杂网络关系进行了研究，挖掘出麻杏石甘汤治疗新型冠状病毒肺炎主要参与抗病毒、抗炎、调节免疫、抗疟、抗肺损伤等多靶点、多通路发挥作用，体现了中医药具有多环节发挥作用的特点。目前疫情尚未结束，国家对中医药诊治极其重视，中医药发挥明显作用，本研究为麻杏石甘汤治疗新型冠状病毒肺炎提供机理参考，尚需要我们进一步深入研究。