郑志慧，曾凡一，秦国文，黄秀秀，李梓良，李彦灵

(新乡医学院三全学院，河南 新乡 453003)

女贞树(LigustrumlucidumAit.)是木犀科植物，分布于华东、华南、西南及华中各地，其药用历史有2 000多年。女贞果实在《神农本草经》中首次提及，谓其可以祛除百病，其味甘、苦，性凉，归肝、肾经，具有滋补肝肾、明目乌发的效果，被称为养生佳品。明代医药学家李时珍谓其“果实强阴健腰膝，乌发，明目”[1]。女贞果实主要用来治疗慢性气管炎[2]、肝癌[3]、高血脂症[4]、糖尿病[5]、骨质酥松[6]、更年期综合征、不孕症、动脉粥样硬化等，近年来成为国内外的研究热点。

女贞含有丰富的三萜类化合物，其次黄酮的含量也十分丰富。黄酮类化合物具有较好的抗炎、抗肿瘤等药理活性[7-8]，此外黄酮类化合物还具有一定的成骨作用[9]，同时某些黄酮类化合物正在临床试验用于丙型肝炎的治疗。女贞的化学成分较为复杂，其质量评价是通过多种成分的含量测定来进行综合评价，黄酮类化合物是女贞质量鉴别的标志物之一[10]。

近年来，通过对女贞不同部位化学活性成分的提取工艺进行研究，发现不同环境包括采摘时间、提取温度等，都对女贞化学成分有着显著的影响。故本实验以女贞总黄酮作为检测标准，通过比较不同时段、不同部位采摘的女贞总黄酮含量变化，为女贞以后的药用研究提供实验依据；在静态工艺的筛选方法上，采用大孔树脂吸附分离技术，对女贞果实总黄酮的纯化工艺进行研究，为女贞果实总黄酮的分离纯化提供实验数据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

女贞子药材采于新乡医学院三全学院内(2018年7月-2019年2月，共13份样品)，由本校中药教研室李彦灵老师鉴定为木犀科植物女贞的干燥成熟果实；芦丁对照片(中国食品药品检定研究院，10080-201408)；D-101大孔树脂(济宁宏明化学试剂有限公司)；无水乙醇等所用试剂均为分析纯。

T6新世纪型号紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限公司)；XFB-500型高速中药粉碎机(中国吉首市中诚制药机械厂)；FA2004型电子天平(d=0.1mg，批号：14D101-1000，上海良平仪器仪表有限公司)；DT5-2型低速离心机(北京时代北利离心机公司)；KQ5200型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；SHZ-3循环水式多用真空泵(郑州杜普仪器厂)。

1.2 女贞黄酮含量的测定

1.2.1 黄酮提取工艺 将每个时段的女贞子洗干净自然风干，至恒重，用粉碎机粉碎成粉末，密封保存贴上标签备用。精密称取1.000 g女贞子，放在100 mL烧杯中，加入70 mL 50%乙醇，浸泡30 min，60 ℃超声处理1 h，对所得浸提液进行离心，3 000 r/min，离心6 min，分离后，将上层清液转移到合适容量瓶中，用50%乙醇补足体积[11]，将1 mL溶液精确转移至25 mL容量瓶中，用于显色、定容并测得吸光度，进而求得总黄酮的含量。

1.2.2 标准曲线的绘制 精密称取芦丁对照品0.100 g，溶解，转移至100 mL容量瓶中，然后用无水甲醇定容至刻度线，摇匀，将5.00 mL溶液转移到一个50 mL容量瓶中，用无水甲醇补足体积，摇匀，此芦丁对照品溶液为0.1 mg/mL。精密移取0.00、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL溶液分别放置在6个大小相同的25 mL的容量瓶中，加入50%乙醇溶液至6 mL，加入5%亚硝酸钠1 mL，摇匀，放置6 min，加入10%的硝酸铝1 mL，摇匀放置6 min，加1.0%的氢氧化钠10.0 mL，再用50%的乙醇定容，摇匀，静止15 min后，以空白溶液为基准，在510 nm处测吸收度，得回归方程[12-13]，结果见图1。

图1 芦丁质量浓度标准曲线

1.2.3 女贞总黄酮率测定 根据“1.2.2”项下得到的回归方程计算总黄酮得率[14-15]。

2 方法学考察

在女贞中总黄酮含量测定方法建立后，从精密度、稳定性、重复性方面进行方法学考察。

3 女贞子总黄酮的纯化

3.1 供试品的制备

取10 g女贞子，制成粗粉末，加入100 mL 50%乙醇，浸泡30 min，超声处理1 h，对所得试液进行抽滤，取残渣重复上步操作。合并两次滤液，浓缩至浸膏，以水分散至100 mg/mL。

3.2 大孔树脂预处理

取一定量D101树脂，浸泡在95%乙醇中24 h，后除去漂浮的树脂与肉眼可见的絮状物。湿法装柱，分别用95%乙醇和水进行洗脱，洗至流出液无色并无异味为止。水洗至无醇味，用5% HCl溶液与 2% NaOH溶液分别浸泡树脂2 h，水洗至中性[16-17]。

3.3 黄酮的纯化

取8 g树脂(湿重)装柱，加入黄酮提取液10 mL湿法装柱，静置1 h，分别以蒸馏水、30%乙醇、70%乙醇各50 mL洗脱。取70%洗脱部位，回收至浸膏，转移至干燥蒸发皿中。在105 ℃下干燥3 h，冷却0.5h后迅速称定质量[18-19]。将称定后的提取物溶于50%乙醇中，定容至100 mL容量瓶中，并准确移取4 mL于50 mL容量瓶中测量吸光度。然后量取20 mL“1.3.1”项下样品液，蒸发至恒重。50%乙醇溶解，稀释至100 mL容量瓶定容，取4 mL于50 mL容量瓶中测定吸光度，计算理论中黄酮类化合物的含量[20-21]。

4 结果分析

4.1 标准曲线绘制

以芦丁质量浓度(μg/mL)为横坐标，吸光度A为纵坐标，制定标准曲线(图1)，测得回归方程：y=0.0296x+0.1197，相关系数R2=0.9999，结果表明，芦丁质量浓度在0～20 μg/mL范围内有良好线性关系。

4.2 方法学考察

4.2.1 精密度试验 准确吸取1 mL供试液并转移至25 mL容量瓶中，空白对照未添加样品溶液，按照标准曲线“加入50%乙醇溶液至6 mL”开始操作，在重复5次测定后，计算出总黄酮的RSD=1.38%，表明仪器精密度良好。试验结果见表1。

表1 女贞子总黄酮含量测定精密度试验结果

4.2.2 稳定性试验 准确吸取1 mL供试液并转移至25 mL容量瓶中，空白对照未添加样品溶液，按照标准曲线“加入50%乙醇溶液至6 mL”开始操作测量，分别在0 min、30 min、60 min、90 min，4个时间段测定，计算结果显示稳定性的RSD=1.35%。表明样品在90 min内稳定性良好，稳定性试验结果见表2。

表2 女贞子总黄酮含量测定稳定性试验结果

4.2.3 重复性试验 准确吸取1 mL供试液并转移至25 mL容量瓶中，空白对照未添加样品溶液，按照标准曲线“加入50%乙醇溶液至6 mL”开始操作。重复6次操作，结果显示女贞子总黄酮的质量浓度为RSD= 3.13%，表明所用实验方法重复性良好。重复性试验结果见表3。

4.3 女贞不同部位总黄酮含量

将2018年7月-2019年2月采摘的共20个样品的女贞子果实及叶子进行风干、粉碎和醇提取，测得总黄酮含量，分别平行测定3次，计算总黄酮含量，结果见表4、图2。

表3 女贞子总黄酮含量测定重复性试验结果

表4 不同部位女贞中总黄酮含量 (mg/g)

图2 不同部位女贞中总黄酮含量对比

4.4 纯化测定结果

对大孔树脂进行预处理，装样洗脱，取 70% 洗脱部位，回收至浸膏。对女贞子总黄酮的纯化率和转移率进行3次平行测定和计算，结果见表5。

5 讨论

本研究显示，女贞子在8月中旬采摘总黄酮含量达到最大值44.77 mg/g；女贞叶在次年1月初期采摘总黄酮含量达到最大值44.11 mg/g，含量总体相差不大。普遍认为女贞子采收期在12月份左右(果实呈紫黑色)，但从实验结果来看，此阶段总黄酮含量并不高，图2显示女贞子在8月末至9月初及次年的1至2月左右总黄酮活性成分含量达到最高，从8、9月之后，随着气温降低，10月初至次年1月初女贞子中总黄酮含量呈现逐渐降低的趋势，但次年1、2月含量却陡然升高。但从图2中发现，女贞叶与女贞子中总黄酮的含量分布规律与以上相反，其中8月初和次年1月初含量较高，8月末到11月末期间虽然有几次小范围的波动，但总体含量相对8月和次年1月含量较低。对比女贞子叶与女贞果实中的总黄酮含量，两者的含量波动同样剧烈，但两者并没有表现出较强的相关性。

表5 女贞子总黄酮纯化结果

女贞子总黄酮纯化实验结果表明，D101型大孔树脂具有较好的吸附性能，纯化后黄酮的纯度为74.05%，转移率为63.81%，表明所用实验方法稳定可行，有较高的参考价值。