周海东，玉蓝青，钟焕铭，农光任，潘朝杰，罗昊翔

(右江民族医学院，广西 百色 533000)

肝癌是常见的恶性肿瘤，据统计，2012年全球和中国肝癌发病总数占癌症总数的5.6%和12.9%，2013年我国死于肝癌的患者为31.6万人[1]，严重危害人民健康。目前对于肝癌的治疗主要有手术切除、动脉栓塞等方法，但这些方法在临床治疗中均有一定的副作用，包括恶心、乏力等。曾有不少使用中药方治愈肝癌的报道，如广州中医药大学周岱翰教授曾使用茵陈蒿汤合五苓散加减辨证施治治疗肝癌1例，存活10年以上[2]。研究表明，茵陈蒿汤及其加减方具有护肝、利胆、抗肿瘤作用，但茵陈蒿汤合五苓散加减方对肝癌的治疗机制尚不清楚，是否与中药方剂调节了体内某些分子的变化有关，目前对此知之甚少。本研究通过使用广州中医药大学周岱翰教授治疗肝癌的方剂茵陈蒿汤合五苓散加减方，熬制汤药，对正常小鼠灌胃，观察实验组和对照组小鼠肝组织内细胞因子IL-6、IL-18的表达，为中药方剂对体内微环境的调节寻找证据，为中医药在临床治疗肿瘤提供分子依据。

1 实验材料与仪器

1.1 试剂

中药购买于百色市一心堂药店，兔抗鼠anti-IL-6、anti-IL-18(武汉博士德生物公司)，免疫组化试剂盒(武汉博士德生物公司，SA2022)，二甲苯、无水乙醇、95%乙醇等。

1.2 实验动物

昆明种SPF级正常小鼠，2～3月龄，共20只，由右江民族医学院实验动物中心提供(SYXK桂20117-0004)。

1.3 仪器

电热烤箱(上海慧泰仪器制造有限公司，型号：DHG-9070A)，显微镜(OLYMPUS，型号：CX21)，水浴箱(国营新医疗器械厂，型号：S648)。

2 方法

2.1 汤药制备

茵陈蒿汤合五苓散加减方(茵陈蒿20 g、党参20 g、栀子15 g、茯苓15 g、猪苓15 g、泽泻15 g、白术15 g、大黄12 g、半枝莲30 g、溪黄草30 g)加水1 500 mL，熬制45 min，最终汤药约750 mL。4 ℃保存备用。

2.2 实验分组及灌胃

对20只小鼠随机分为实验组和对照组，每组各10只，正常喂食、喂水，每次灌胃前将灌胃针煮沸消毒10 min左右，中药汤剂从4 ℃冰箱取出，37 ℃水浴加热后，对实验组灌胃给药1 mL/只，4 h/次，2次/d，对照组不予处理。

2.3 取材方法

于灌胃第2天后，每天第2次灌胃4 h后，颈椎脱臼处死实验组和对照组小鼠各1只，无菌取肝脏，甲醛固定。

2.4 免疫组化检测

将所有小鼠取材后，制作石蜡切片，4 ℃下保存，脱蜡前置于电热烤箱65 ℃下烘烤20 min，将每张石蜡切片脱蜡至水，PBS溶液洗涤5 min；将切片置于湿盒，滴加3%H2O2，于37 ℃恒温水浴孵育10 min；用PBS洗涤2次，2 min/次，滴加BSA，37 ℃恒温水浴封闭；30 min后弃多余BSA，分别滴加兔抗鼠anti-IL-6、anti-IL-18一抗，置于湿盒中，37 ℃水浴孵化2 h；移去一抗，PBS洗涤3次，2 min/次，滴加过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗，37 ℃湿盒孵育30 min，滴加显色剂(DAB：A、B、C各25 μL，加纯水1 000 μL)，镜下观察。

3 结果

3.1 茵陈蒿汤合五苓散加减方对小鼠体内细胞因子IL-6的影响

图1 茵陈蒿汤合五苓散加减方对小鼠体内细胞因子IL-6的影响

通过图1可以看出，A图为对照组小鼠肝组织IL-6免疫组化染色结果，从结果可以看出，在对照组正常小鼠中央静脉和小叶间静脉管壁都有阳性染色(棕红色)；B图为实验组小鼠使用茵陈蒿汤合五苓散方灌胃第5天肝组织免疫组化的结果，中央静脉管壁已无阳性染色，只有小叶间静脉还有阳性染色；C图实验组小鼠使用茵陈蒿汤合五苓散方灌胃第6天肝组织免疫组化的结果，肝组织未发现阳性染色部位。

3.2 茵陈蒿汤合五苓散加减方对小鼠体内细胞因子IL-18的影响

图2 茵陈蒿汤合五苓散加减方对小鼠体内细胞因子IL-18的影响

通过图2可以看出，A图为对照组小鼠肝组织IL-18免疫组化染色结果，对照组正常小鼠肝组织内部大部分区域都有细胞呈阳性染色(棕红色)；B图为实验组小鼠使用茵陈蒿汤合五苓散方灌胃第5天肝组织免疫组化染色的结果，肝组织内部大部分区域已无细胞呈阳性染色，只有肝脏边缘还有部分细胞呈阳性染色；C图为实验组小鼠使用茵陈蒿汤合五苓散方灌胃第6天肝组织免疫组化染色的结果，肝组织未发现阳性染色部位。

4 讨论

研究表明，炎症与肿瘤的发生发展有密切关系，炎症的迁延不愈可导致肿瘤的发生。IL-6、IL-18是机体内重要的炎症因子，IL-6或IL-8等炎性细胞因子的激活，可促进肝脏间质细胞纤维化改变。IL-6主要与炎症的发生以及肿瘤的发生转移相关，正常情况下机体内IL-6也有表达[3]，但含量较低，当发生炎症时IL-6会被巨噬细胞、B细胞以及T细胞大量分泌[4]，IL-6可通过STAT3信号传导通路参与炎症反应的发生，活化的STAT3又可上调TGF-1和下调其他致炎因子，这些炎症因子又与抑制抗肿瘤免疫有关。此外，IL-6的持续性增高会加速肝细胞的损伤，迫使肝细胞发生“破坏-修复-破坏”的循环，在一定程度上参与了肿瘤的发生[5-9]。FUKE H等[10]对肝癌患者标本进行检测发现STAT3的过度激活是IL-6/gp130高表达的结果，可见IL-6在肝癌的发生过程中可能存在重要作用。本实验研究表明，对照组小鼠肝组织IL-6免疫组化染色显示小血管管壁明显强阳性染色，而实验组经茵陈蒿汤合五苓散加减方灌胃后，IL-6的表达随着灌胃次数的增加有逐渐减少的趋势，于灌胃第5天，肝组织小血管管壁中IL-6的表达明显下降，于灌胃第6天，肝组织中IL-6检测呈阴性，可见茵陈蒿汤合五苓散加减方能调节IL-6的表达，茵陈蒿汤合五苓散加减方可能通过下调IL-6的表达，进而改变信号通路，达到护肝、抗肿瘤的功效。

IL-18也是一种炎症刺激因子[11]，直接参与肝损伤，其参与肝损伤的机制可通过PAMPs通路，激活NLRP3炎症小体，促使Caspase-1成熟，活化的Caspase-1可以使IL-18激活并使之聚集，大量的IL-18浸润导致细胞损伤[12]。潮蓉[13]在研究酒精性肝损伤机制中发现，酒精性肝损伤小鼠IL-18表达明显增强，说明IL-18也是肝损伤发生过程中的重要分子。本实验研究发现，对照组小鼠肝组织中大部分区域都有细胞IL-18呈阳性染色，经茵陈蒿汤合五苓散加减方灌胃第5天发现IL-18阳性染色区域明显减少，灌胃第6天，肝组织IL-18未发现阳性染色，表明茵陈蒿汤合五苓散加减方可调节IL-18的表达，有可能使用茵陈蒿汤合五苓散通过调节细胞因子，进而达到护肝、防治肝损伤乃至预防和治疗肝癌的目的。