申奔龙, 陈晓佳, 黄小红, 张伟妮,2

(1.福建农林大学中西兽医结合与动物保健福建省高校重点实验室；2.福建农林大学海洋研究院，福建 福州 350002)

罗非鱼(Oreochromissp.)是我国重要的养殖鱼类之一，中国罗非鱼的产量占世界总产量的40%以上[1].罗非鱼因具有生长速度快、生存能力强和抗病力强等特点，易于池塘、网箱、稻田或浮筏养殖，又因其肉质好、口感好、蛋白质含量高[2]，长期以来受许多发展中国家人民的喜爱.

N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(N-acetyl-β-D-glucosaminidase, NAGase)是一种重要的溶酶体酶，主要水解糖蛋白、蛋白聚糖及多糖分子内以β-1,4-糖苷键连接的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷键，同时它也是几丁质降解途径中的限速酶，参与新表皮的形成[3-4].NAGase来源广泛，在微生物、动物和植物体内均有存在[5-7]，且功能因物种种类或因分布位置不同而千差万别，在水产动物中同样如此.如虹鳟精卵细胞中的NAGase活性可对受精率产生影响[8]；甲壳动物中锯缘青蟹内表皮NAGase活力的变化趋势表现出一定的季节性规律[9]；日本沼虾NAGase已被证实与幼虾蜕皮相关[10].

PUGNAc，全称：O-(2-acetamido-2-deoxy-D-glucopyranosylidene) amino-N-phenylcarbamate，在1991年被证实为一种新型的β-N-乙酰氨基葡糖苷酶抑制剂[11]，此后又被发现可抑制人体细胞中的O-GlcNAcase[12]，导致Ⅱ型糖尿病和阿尔茨海默氏病等几种疾病的发生，因此被广泛应用于各种生物和医药方面的研究[13-14]，但目前在鱼类中应用PUGNAc进行NAGase的相关研究尚无报道.本试验以罗非鱼肝脏NAGase为材料，研究PUGNAc对NAGase的抑制作用，旨在进一步探究鱼体内该酶的生物学功能.

1 材料与方法

1.1 材料

底物对硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷(pNP-NAc)购于上海医药工业研究院；PUGNAc购于美国Sigma公司；其他无机试剂(AR级国产分析纯)均购于国药集团化学试剂有限公司；使用的蒸馏水为双蒸去离子水.

本试验中所用的NAGase系前期从尼罗罗非鱼肝脏中采用硫酸铵(30%～70%)分级沉淀、DEAE Sepharose Fast Flow离子交换层析、Sephadex G-200分子筛层析的方法分离纯化所得，比活力为2 988 U·mg-1[15].

1.2 方法

酶活力的测定参照文献[16]的方法.PUGNAc对酶的抑制机理和抑制类型的测定参照文献[17]的方法.根据Tsou[18]的底物反应动力学方法研究PUGNAc对罗非鱼肝脏NAGase的抑制作用：2 mL 0.1 mol·L-1磷酸盐缓冲液(pH 5.7)的测酶活力体系，于37 ℃水浴5 min，加入20 μL酶液，实时监测不同底物浓度(0.20、0.25、0.30、0.40 mmol·L-1)和不同浓度(0.2、0.4、0.6、0.8 μmol·L-1)PUGNAc反应体系的反应过程.根据相应的方程和做图方法，分析底物反应动力学曲线求得反应速度常数.

式中：E、S、I和P分别表示酶、底物、PUGNAc和产物；ES、EI和EIS则分别表示酶和底物结合的复合物、酶和PUGNAc结合的复合物以及酶、底物和PUGNAc结合的复合物.一般来说，当底物浓度([S])≫初始酶浓度([E0])以及PUGNAc浓度([I])≫[E0]时，产物生成量的公式如下所示.

(1)

(2)

(3)

公式(1)～(3)中：[P]t表示反应时间为t时的产物生成量；A和B分别表示表观正向抑制速度常数和表观反向抑制速度常数；v表示不存在PUGNAc时的初始反应速度.根据米氏方程v=(Vm×[S])/(Km+[S])，当t足够大时，产物生成量曲线趋于直线，产物生成量([P]calc)的公式如下所示.

(4)

结合公式(1)和(4)，可得：

(5)

公式(5)中，[P]calc是通过公式(4)计算所得，为直线部分推断出的产物量，而[P]t则是实际观察得到的产物量.在不同浓度的PUGNAc溶液中，以ln([P]calc-[P]t)对t做图得到一组斜率为-(A[I]+B)的直线.将以上所做图中的直线斜率对[I]做图得到一条直线，A和B可以通过该图的截距和斜率求得.

结合公式(2)和米氏方程v=(Vm×[S])/(Km+[S])，得到：

(6)

2 结果与分析

2.1 PUGNAc对NAGase活力的影响

在磷酸盐测活体系下，通过改变加入PUGNAc的浓度(0～2.0 μmol·L-1)来测定其对NAGase活力的影响.结果(图1)显示，体系中NAGase对底物的水解力随着PUGNAc浓度的增大而降低，当NAGase的相对活力降至50%时，PUGNAc的浓度为0.18 μmol·L-1.

2.2 PUGNAc对NAGase的抑制机理

不同PUGNAc浓度下NAGase活力与NAGase含量的关系如图2所示.在不同的抑制剂浓度下，以NAGase剩余活力为纵坐标，NAGase含量为横坐标，得到一组过原点的直线，直线斜率随着抑制剂浓度的增大而逐渐减小.由此可知，抑制剂对NAGase的抑制作用是可逆的.PUGNAc的存在并没有减少有效酶的量，只是抑制和减弱了酶活力.

图1 不同浓度PUGNAc对NAGase活力的影响
Fig.1 Effects of different concentrations of PUGNAc on the activity of NAGase

0～4分别为0、0.2、0.4、0.6、0.8 μmol·L-1PUGNAc磷酸盐测活体系.
图2 PUGNAc对NAGase的抑制机理
Fig.2 Inhibitory mechanism of PUGNAc on NAGase

2.3 PUGNAc对NAGase的抑制类型

底物磷酸盐测活体系中，在抑制剂PUGNAc浓度变化的情况下，改变底物的量(0.10、0.15、0.20、0.25 mmol·L-1)，测得其光密度(D).通过Lineweaver-Burk双倒数做图法，得到一组交于第2象限且截距和斜率均不同的直线(图3a).图3a显示，酶促反应的最大反应速度Vm随着抑制剂浓度的增大而变小，表明PUGNAc对NAGase的抑制类型属于混合性抑制，推测PUGNAc可同时抑制游离酶以及酶—底物复合物的活性.图3a中直线的斜率对抑制剂浓度做图可得图3b.通过图3b中直线与截距求得PUGNAc与游离酶结合的抑制平衡常数KI为0.110 μmol·L-1.由图3a中直线的截距对抑制剂浓度做图可得图3c.通过图3c中直线与截距可以求得PUGNAc与酶—底物复合物结合的抑制平衡常数KIS为0.827 μmol·L-1.

2.4 PUGNAc对NAGase的抑制动力学

2.4.1 不同PUGNAc浓度对NAGase的抑制动力学 设置不同PUGNAc浓度(0、0.2、0.4、0.6、0.8 μmol·L-1)的磷酸盐测活体系，以监测NAGase水解底物pNP-NAG的产物量.图4a显示，底物浓度为0.3 mmol·L-1时，在不同浓度的PUGNAc作用下，该酶水解底物的速率随着时间的增加不断减慢直到趋于一条直线，且直线的斜率随着PUGNAc浓度的增大而减小.用Tsou[18]的方法分析以上结果，发现加入PUGNAc后，酶水解底物的反应是一个缓慢且可逆的过程.根据公式(6)，将ln([P]calc-[P]t)对t在不同PUGNAc浓度下做图得到一组斜率为-(A[I]+B)的直线(图4b).

2.4.2 不同底物浓度下PUGNAc对NAGase的抑制动力学 在含有不同PUGNAc浓度(0.2、0.4、0.6、0.8 μmol·L-1)的溶液中，改变底物浓度，以检测底物对酶水解底物的影响，结果如图5a所示.图5a显示，当t足够长时，v和虚线的斜率随底物浓度的增大而增大.ln([P]calc-[P]t)对t在不同底物浓度下做图，得到一组斜率为-(A[I]+B)的直线(图5b).

2.5 NAGase微观速率常数的计算

1～4：底物浓度分别为0.20、0.25、0.30、0.40 mmol·L-1.
图6 ln([P]calc-[P]t)对t的直线图的负斜率对[I]做图
Fig.6 Secondary plots of the slopes against the concentration of PUGNAc

A来自图6中直线的斜率.
图7A/v对1/[S]做图
Fig.7 Plot ofA/vversus 1/[S]

表1 PUGNAc对NAGase的微观速率常数和抑制平衡常数Table 1 Inhibitory equilibrium constants and microscopic rate constants for NAGase in PUGNAc solution

3 讨论

NAGase是一种广泛分布于生物体内的重要水解酶，本课题组前期研究表明，罗非鱼肝脏NAGase的比活力最高(肝脏为196.5 U·mg-1，肾脏为42.3 U·mg-1，精巢为36.3 U·mg-1，脾脏为12.6 U·mg-1，卵巢为6.1 U·mg-1).抑制剂对研究糖苷水解酶的性质和结构有极大的帮助[19].因此，本试验研究了N-乙酰己糖苷酶的抑制剂PUGNAc对罗非鱼肝脏NAGase的抑制动力学，为进一步研究该酶的功能提供依据.

本试验结果表明，PUGNAc可强烈抑制罗非鱼肝脏NAGase的活性，IC50为0.18 μmol·L-1.Dong et al[20]研究得出，PUGNAc对鼠脾脏细胞质中O-GlcNAcase的IC50为0.15 μmol·L-1.Meekrathok et al[21]在研究3种抑制剂(PUGNAc、NHAcCAS、NHAcDNJ)对哈维氏弧菌中GlcNAcase的剂量反应时发现，PUGNAc抑制效果最好且具有最低的IC50(1.2 μmol·L-1).可见，抑制剂PUGNAc对鼠体内该酶的IC50与本试验试验值较接近，但在细菌体内该酶的IC50与本试验结果差距较大，初步猜测可能是动物间NAGase的功能较动物与微生物间的差距较小.

本试验结果还表明，PUGNAc对NAGase的抑制机理是一种缓慢的可逆过程，抑制类型为混合性.PUGNAc对人体结肠癌HT29细胞中O-GlcNAcase的抑制机理为可逆的，抑制类型为竞争性抑制[12]，与本试验结果相同.此外，甜菜碱和过氧化氢对南美白对虾NAGase的抑制机理和抑制类型[22-23]也与本试验结果一致.

本试验为下一步进行罗非鱼肝脏NAGase的生物学功能研究提供依据.