顾建锋, 于海英, 刘乐乐, 方亦午

(1.宁波海关技术中心/宁波检验检疫科学技术研究院,浙江 宁波 315100；2.国家林业和草原局森林和草原病虫害防治总站，辽宁 沈阳 110034)

松材线虫[Bursaphelenchusxylophilus(Steiner & Buhrer, 1934) Nickle, 1970]引起的松树萎蔫病在北美的美国和加拿大,亚洲的中国、日本和韩国,以及欧洲的葡萄牙和西班牙扩散，其在世界范围内传播的最重要途径之一是通过木质包装及原木的国际运输.因此，这些木质材料中的伞滑刃线虫属(Bursaphelenchus)种类引起了学者们的极大关注，伞滑刃线虫属的研究不断深入.目前，全球已报道的伞滑刃线虫属约125种[1]，其中近20种在我国已有报道[2].

伞滑刃线虫属中的松材线虫和椰子红环腐线虫[B.cocophilus(Cobb,1919) Baujard, 1989]具有较强的致病性，能严重危害林业生产和生态环境，是国际重要检疫对象.此外，接种测试表明其他10种伞滑刃线虫可能具有弱或中等致病性[1]，分别为拟松材线虫(B.mucronatusMamiya & Enda, 1979)、日本冷杉伞滑刃线虫(B.firmaeKanzaki, Maehara, Aikawa & Matsumoto, 2012)、灰黄锦天牛伞滑刃线虫(B.luxuriosaeKanzaki & Futai, 2003)、十二齿小蠹伞滑刃线虫[B.sexdentatiRühm, 1960 (Hunt, 1993)]、利昂伞滑刃线虫(B.leoniBaujard, 1980)、赫列尼伞滑刃线虫(B.hellenicusSkarmoutsos, Braasch & Michalopoulou, 1998)、安娜摩伞滑刃线虫(B.anamuriusAkbulut, Braasch, Baysal, Brandstetter & Burgermeister, 2007)、瓦里西伞滑刃线虫(B.vallesianusBrassch, Shönfeld, Polomski & Burgermeister, 2004)、甬伞滑刃线虫(B.yongensisGu, Brassch & Burgermeister, 2006),以及清原伞滑刃线虫(B.kiyoharaiKanzaki, Maehara, Aikawa, Masuya & Giblin-Davis, 2011).

2018年8月，作者从一批来自吉林省辽源市的红松(PinuskoraiensisSieb. et Zucc.)枯死木中发现一种伞滑刃线虫属群体，经形态学鉴定和分子生物学特征分析，将该群体鉴定为十二齿小蠹伞滑刃线虫.鉴于该种线虫可能具有致病性，且为我国新记录种，现将鉴定结果报道如下.

1 材料与方法

1.1 样本的采集和线虫的分离

采集吉林省辽源市枯死红松树木样，死树横切面有明显的蓝变症状，但未发现蛀干害虫为害状.采用改良贝曼漏斗法[3]对木样进行线虫分离.将木样劈成长10 cm、宽1 cm左右的薄片，置于漏斗中，加入适量水淹没木片，25 ℃恒温培养24 h后，用表面皿接取5～10 mL线虫分离液，在体视显微镜下观察.

1.2 线虫的形态鉴定与形态特征测计

用Zeiss Imager Z1显微镜和Axioscop MRm数码相机对线虫的整体形态特征进行观察和拍照，并用De Man公式进行形态特征测计[4].根据形态特征和测计结果，结合相关文献，对该线虫群体进行鉴定.

1.3 分子生物学鉴定

单条线虫DNA的提取参照王江岭等[5]的方法，分别提取了3条线虫的DNA.利用引物对F194(5′-CGT AAC AAG GTA GCT GTAG-3′)[6]和5386r(5′-TTT CAC TCG CCG TTA CTA AGG-3′)[7]扩增ITS区基因片段，PCR反应程序参照Ferris et al[6]和Vrain[7]的方法，PCR扩增产物直接送上海美吉生物科技有限公司进行双向测序.

使用ChormasPro软件对ITS基因测序得到的双向峰图文件进行拼接，去除测序结果两端的低质量序列.登录NCBI网站的BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行比对.在NCBI中下载已登录的伞滑刃线虫各近似种的ITS序列，以Aphelenchoidesbesseyi为外群，选用Kimura 2-parameter模型、Bootstrap值1 000，用MEGA6构建Neighbor-Joining系统进化树.

2 结果与分析

2.1 吉林线虫群体的形态特征测计值

从吉林省辽源市枯死红松树100 g木样中分离到900多条伞滑刃线虫，对该群体形态特征进行测计，具体测计值见表1.

表1 十二齿小蠹伞滑刃线虫吉林群体与原始描述群体的测计值比较Table 1 Comparison on the morphometrics between the B.sexdentati population from Jilin and the population with original descriptions

续表1

指标吉林群体1)雄虫雌虫原始文献[8]雄虫雌虫后阴子宫囊长/阴门至肛门的距离/%-60.3±9.4(44.9～77.3)肛门(泄殖腔)处体宽/μm16.5±0.8(15.3～18.1)13.4±1.8(10.7～17.4)尾长/μm44.2±3.9(37.7～51.2)36.7±5.6(29.3～49.2)33～4035～48交合刺长(中弧线)/μm16.9±1.6(13.9～20.6)-交合刺长(直线)/μm18.4±1.3(15.4～20.4)-19～22头端至食道与肠交接处距离/μm79.9±3.7(70.9～86.6)79.1±4.1(69.2～84.0)头端至食道腺末端距离/μm156±11.8(141～179)142±15.5(115～163)

1)数据为平均值±标准差,括号内为所测数据的范围.

2.2 形态描述

雄虫：热杀死后，虫体后端显著向腹面弯曲，呈 “J”形.侧区宽3～4 μm，侧线4条(图1D).唇区高，缢缩明显，唇高约3.3 μm，宽约7.2 μm(图1B).口针长约15 μm，无基部球，口针基部轻微膨大，针锥部大约占口针长度的41%(图1B).中食道球卵圆形，长度大于宽度；排泄孔位于中食道球后缘之前或略靠后(图1A).食道腺从背面覆盖肠前端，长为体宽的2.5～3.0倍(图1C).单精巢前伸，占体长的1/4～1/2，精母细胞多行排列.交合刺较大，成对，不愈合，呈手套状，长15～20 μm；基顶略向背面弯曲，近方形；喙突长2.0～2.5 μm，末端锐尖(图1E-H).远端盘状突通常不明显(图1E-H).尾强烈弯曲呈爪状，末端具卵圆形交合伞(图1I、1J).尾乳突7个，P1单乳突位于泄殖腔口前腹中位3～4 μm，P2一对乳突位于泄殖腔口亚腹侧位，P3一对乳突位于交合伞起始处，P4一对乳突在P3之后约5 μm处(图1E-F、1H-J).

雌虫：虫体细长，热杀死后略向腹面弯曲，体表有细环纹，前部似雄虫.单生殖管前伸，占体长的1/3～1/2.卵母细胞单行或多行排列，前端有时有回折.受精囊明显，长椭圆形或不规则，有时充满精子.阴门前唇略向后延伸形成小阴门盖，后唇略膨大后形成明显的缢缩，偶见后唇膨大非常显著(图2A).后阴子宫囊约占肛阴距的1/2以上；尾圆锥形或近圆柱形，渐变细，末端多数钝圆，有时钝尖，偶尔呈尾尖突状(图2B-I)；尾长约为肛门处宽的2.7倍.

2.3 吉林群体与近似种的区别

根据4条侧线、唇区缢缩明显、有小阴门盖、尾乳突数量和位置、交合刺形状等特征，可将该吉林群体归入伞滑刃线虫属的sexdentati组[9].sexdentati组成员包括B.sexdentati、B.vallesianus、B.pinophilus、B.poligraphi、B.fuchsi和B.andrassyi，这些种类已经过序列分析证实[9].该组线虫形态特殊，很容易与伞滑刃线虫属的其他组区别开，但sexdentati组内成员的形态近似，较难区分.

B.sexdentati与B.vallesianus[10]十分相似，区别在于雌虫尾部(钝圆vs锥形)和口针长(15 μm vs 13 μm)；同时，前者交合刺远端一般无明显的盘状突，而后者有小盘状突.B.sexdentati与B.pinophilus[11]比较，前者尾圆锥形或近圆柱形，渐变细，末端多数钝圆，后者尾近锥形，末端常锐尖，有时呈尾尖突状；前者交合刺盘状突不明显，后者有小盘状突.B.sexdentati与B.poligraphi[12]比较，后者雌虫尾呈楔形，末端尖，且交合刺更粗壮，基顶更高.B.sexdentati与B.fuchsi[13]比较，主要区别是雌虫尾部，后者尾圆锥形，尾端钝尖，有时呈尾尖突状.B.sexdentati与B.andrassyi[14]相比，前者阴门后有显著凹陷，后者凹陷不明显；口针长度(13～17 μm vs 12～14 μm)和交合刺长度(15～20 μm vs 11～14 μm)也存在差异.

2.4 分子生物学特征

通过对该吉林群体的ITS基因片段进行扩增和测序，共获得3条ITS序列，片段大小均为981 bp，序列间有2～3个碱基的差异；GenBank登录号分别为MK411347、MK411348和MK411349，与B.sexdentati其他中欧型群体的序列相似度高达99%～100%，但与南欧型群体的序列相似度只有93%～94%.从基于ITS基因序列构建的系统进化树(图3)来看，B.sexdentati、B.vallesianus、B.pinophilus、B.poligraphi、B.fuchsi和B.andrassyi聚类在一个大分支，即为sexdentati组[7].但是B.sexdentati的中欧型群体与南欧型群体分别聚类形成两个不同的分支，吉林群体的3条序列均位于中欧型的进化支中.

需要特别说明的是，目前GenBank中登录的B.borealis序列，应该都是B.fuchsi.因为B.borealis明显属于leoni组，而GenBank中的B.borealis序列都应为sexdentati组[9].

综上所述，来自吉林省辽源市红松中的伞滑刃线虫群体应为十二齿小蠹伞滑刃线虫(B.sexdentati).

3 讨论

十二齿小蠹伞滑刃线虫最早于1958年在德国被发现[8]，目前主要分布于德国、瑞士、希腊、意大利、葡萄牙等欧洲国家[15].该线虫一般由十二齿小蠹(Ipssexdentatus)携带并传播，生活于木材或小蠹的蛀孔中；其寄主树种主要是松属(Pinussp.)、云杉属(Piceasp.)等[16].

目前已经通过分子生物学研究明确了B.sexdentati、B.vallesianus、B.pinophilus、B.poligraphi、B.fuchsi和B.andrassyi6种属于sexdentati组的成员[8].该组可能还包括B.pityogeni、B.nuesslini、B.incurvus和B.piniperdae等，其准确性还有待进一步证实.1980年Baujard[17]从法国海岸松(Pinuspinaster)中发现的B.naujaci与B.sexdentati十分接近，可能为异名.

Lange et al[15]根据形态特征和分子差异，将B.sexdentati分为中欧型和南欧型2个种群，中欧型群体的交合刺基顶多为方形，盘状突不明显，雌虫尾末端多钝圆，而南欧型群体(顾建锋等将该群体确定为新种B.dietrichi，论文待发表)的交合刺基顶背弯更显著，盘状突较明显，雌虫尾锥形且末端钝尖.根据形态特征,吉林群体明显属于中欧型种群.从进化树来看，B.sexdentati中欧型群体和南欧型群体很可能为2个种，但尚需更多的研究作为支持.

Skarmoutsos et al[18]用B.sexdentati的4个群体GR-5(W)、GR-7(W)、GR-8(W)和GR-31(W)分别在温室和室外接种多种3年生的松树，结果发现无论是室内还是室外接种，松苗的死亡率都高达90%，且从枯死树苗中分离到大量的B.sexdentati群体.Dayi et al[19]明确Skarmoutsos et al[18]所用的B.sexdentatiGR-7(W)和GR-8(W)株系为B.vallesianus.作者从吉林省辽源市采集到红松枯死树5株，从其中2株枯死树中分离到了B.sexdentati，50 g木样的虫口数高达400条以上.有关B.sexdentati吉林群体是否有致病性还有待进一步研究.此外，2007年宁波口岸曾从来自德国的木质包装中截获B.sexdentati[16]，该线虫为我国本土种还是入侵物种，尚需进一步研究.