周嘉鑫, 黄义强, 林智鑫, 王全溪, 高玉云, 王长康

(福建农林大学动物科学学院，福建 福州 350002)

随着国家对部分抗生素的禁用，未来禁止在饲料中添加抗生素已是大势所趋.酸化剂能改善饲料的适口性，提高动物采食量，促进胃肠道黏膜上皮生长，调整和改善消化道的内环境，抑制和杀灭有害菌，调节胃排空速度，提高营养物质的消化和吸收，从而提高动物的生产性能[1].甲酸(formic acid, FA)除了具有可降低胃肠道pH的常规特点外，还可直接进入致病菌细胞内酸化细胞的内环境，阻碍其遗传物质及蛋白质的合成，抑制致病菌的生长与繁殖，具有极强的抗菌特性[2]，但由于FA的强腐蚀性可能会对肠道造成损伤，在生产中的应用并不广泛.木质磺酸(lignosulfonic acid, LA)已被证明对小鼠具有降血糖和抗菌等功能[3-4]，但在畜牧业中鲜有LA的应用报道，LA在畜牧业中具有很大的开发应用潜力.LA是一种高分子、体积大及芳香环上位阻大的物质[5]，这些特点导致LA反应活性低，只有在特殊条件下才会发生化学反应，如强酸的环境下[6].LA特殊的阴性大分子空间结构，对小分子有机酸等阳性分子具有极强的吸附作用[7].因此，LA与FA混合后，LA可以作为FA的载体使混合物维持相对稳定的状态.在动物饮用水中添加甲酸与木质磺酸的混合物(mixture of formic acid and lignosulfonic acid, MFALA)，期望LA能够改善FA易挥发、腐蚀性强及破坏日粮营养成分等问题并维持肠道健康[8].本试验在饮用水中添加不同比例的MFALA，研究MFALA对黄羽肉鸡生产性能及空肠组织结构、紧密连接蛋白和免疫因子的影响，并探讨适宜的添加量，为黄羽肉鸡的生产应用提供依据.

1 材料与方法

1.1 材料

40% LA和98% FA由麦仑(漳州)生物科技有限公司提供.240羽1日龄黄羽肉鸡公雏购自福建莆田广东温氏家禽有限公司.

1.2 试验设计

将240羽1日龄体重相近的雄性黄羽肉鸡随机分为4组，每组设5个重复，每个重复12只鸡.试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ组肉鸡在饲喂基础日粮的基础上，分别饮用含0%、0.15%、0.20%和0.25% MFALA的水，试验期21 d.在MFALA中，FA占比60%，LA占比40%.

1.3 日粮的配制

基础日粮参照NY/T 33—2004[9]的方法配制.基础日粮组成及营养水平见表1，供试日粮为粉状料.

表1 基础日粮组成及营养水平(风干基础)Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis)

1)预混料为每千克日粮提供9 100 IU VA、2 100 IU VD3、21 IU VE、2.1 mg VK3、2.1 mg VB1、5.1 mg VB2、3.6 mg VB6、0.02 mg VB12、36 mg烟酸、11 mg泛酸钙、1.1 mg叶酸、0.16 mg生物素、700 mg氯化胆碱、8 mg Cu、80 mg Fe、 80 mg Mn、80 mg Zn、0.35 mg I、0.25 mg Se；2)代谢能为计算值.

1.4 饲养管理

试验鸡自由采食、饮水，全程采用笼养的方式饲喂21 d，每天光照24 h，采用福建莆田广东温氏家禽有限公司提供的方法进行常规免疫.

1.5 样品采集及制备

肉鸡饲喂21 d后禁食12 h，称重，各重复选取2只体重中等的肉鸡进行屠宰取样.开膛后，剥离空肠，迅速放入液氮罐中，再转至-80 ℃低温冰箱冻存.取3小段空肠中段，经磷酸盐缓冲液冲洗后，两段装入标记好的10 mL离心管中，迅速放入液氮罐中，再转至-80 ℃低温冰箱冻存；另一段用于组织切片.

1.6 指标的观察与测定

1.6.1 生长性能 测定内容包括平均日采食量、平均日增重和料重比等.

1.6.2 空肠组织结构 空肠组织经4%多聚甲醛磷酸缓冲液固定、无水乙醇脱水后用石蜡包埋，连续切片(每块肠段切3片，厚度5 μm)、脱蜡、HE染色、封片，使用显微镜观察测量绒毛高度和隐窝深度，并计算绒毛高度与隐窝深度的比值.

1.6.3 空肠紧密连接蛋白occludin、claudin-1基因及免疫因子IL-4、IL-6基因的表达 采用Total RNA Kit Ⅰ(美国OMEGA公司)提取空肠总RNA，然后用Eastep®RT Master Mix Kit(美国Promega公司)对RNA进行反转录，所得的cDNA用Go Taq®qPCR Master Mix(美国Promega公司)进行实时荧光定量PCR反应.内参基因及目的基因的上下游引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，引物序列见表2.实时荧光定量PCR反应结束后计算内参基因和目的基因的Ct值，利用2-△△Ct公式计算目的基因的相对表达量.

表2 内参基因和目的基因的引物序列Table 2 Primer sequences of reference genes and target genes

1.7 数据处理

试验数据以平均值±标准差表示，采用SPSS 16.0统计软件进行单因素方差分析，采用LSD法进行多重比较.

2 结果与分析

2.1 MFALA对黄羽肉鸡生长性能的影响

由表3可以看出，Ⅱ组肉鸡的平均日增重显著高于Ⅰ组(P<0.05)，各组间的平均日采食量、料重比和成活率差异不显著(P>0.05).

表3 MFALA对黄羽肉鸡生长性能的影响1)Table 3 Effects of MFALA on the growth performance of yellow broilers

1)同列数据后附不同字母者表示差异显著(P<0.05)，附相同字母者或无字母者表示差异不显著(P>0.05).

2.2 MFALA对黄羽肉鸡空肠组织结构的影响

由表4可知：Ⅱ组肉鸡空肠的绒毛高度显著高于Ⅰ组(P<0.05)，各组间的隐窝深度差异不显著(P>0.05)；Ⅱ组肉鸡的绒毛高度/隐窝深度显著高于Ⅰ组(P<0.05).

表4 MFALA对黄羽肉鸡空肠组织结构的影响1)Table 4 Effect of MFALA on the jejunal structure integrity of yellow broiler

1)同列数据后附不同字母者表示差异显著(P<0.05)，附相同字母者或无字母者表示差异不显著(P>0.05).

2.3 MFALA对黄羽肉鸡空肠紧密连接蛋白和免疫因子基因mRNA相对表达量的影响

由图1可知：Ⅱ组肉鸡空肠occludin和claudin-1基因mRNA的相对表达量显著高于Ⅰ组(P<0.05)，其余各组间的差异不显著(P>0.05)；Ⅰ组肉鸡空肠IL-4基因mRNA的相对表达量显著低于Ⅱ和Ⅲ组(P<0.05)，Ⅲ组显著高于Ⅳ组(P<0.05)，其余各组间的差异不显著(P>0.05)；Ⅰ组肉鸡空肠IL-6基因mRNA的相对表达量显著高于Ⅱ和Ⅳ组(P<0.05)，其余各组间的差异不显著(P>0.05).

3 讨论

3.1 MFALA对黄羽肉鸡生长性能的影响

本试验结果表明，在饮用水中添加MFALA显著提高黄羽肉鸡的平均日增重，此结果与其他学者[8，10-12]研究FA对畜禽生长性能影响的结论类似.Panda et al[10]研究表明，在日粮中添加0.6% FA可以显著提高42日龄肉鸡的体增重，显著降低料重比，且与添加抗生素组的效果相当，但1% FA组的效果不显著.Ragaa et al[11]研究表明，在日粮中添加0.5% FA可以显著提高35日龄肉鸡的体增重，显著降低料重比，且与添加0.5%二甲酸钾组的效果相当.Ragaa et al[8]研究表明，在日粮中添加0.5% FA可以显著提高35日龄肉鸡的体增重，显著降低料重比和采食量，且与添加0.5% FA+0.1%百里香酚组的效果相当.Ghazalah et al[12]研究表明，在日粮中添加0.5% FA能显著提高42日龄肉鸡的体增重，但添加1%组与对照组的差异不显著.本试验根据上述研究结果结合雏鸡饮水量与采食量的关系[13]设计了MFALA浓度梯度，试验结果与上述研究结果相符.据报道，FA能显著抑制肠道中大肠杆菌和沙门氏菌的定植，有效促进乳酸杆菌的繁殖[14].目前在畜牧业中鲜有LA的相关研究报道，但已有报道指出LA对小鼠有广泛抗病毒的能力，其中包括抗艾滋病病毒和抗单纯疱疹病毒[15].本试验中，黄羽肉鸡生产性能的提高可能是由于MFALA提高了机体的免疫能力，而Ⅲ和Ⅳ组肉鸡的生长性能与Ⅰ组相比差异不显著，可能是MFALA超过了饮用水最佳的添加量.

3.2 MFALA对黄羽肉鸡空肠组织结构的影响

肠道绒毛高度、隐窝深度和绒毛表面积是体现小肠吸收能力的主要指标[16].Ragaa et al[11]研究表明，在日粮中添加0.5% FA或0.5%二甲酸钾可显著提高42日龄肉鸡回肠的绒毛高度及绒毛高度与隐窝深度的比值.Hernández et al[17]研究表明，在日粮中添加0.5% FA能显著提高42日龄肉鸡十二指肠的绒毛高度和隐窝深度，但绒毛高度与添加1% FA组的差异不显著.刁慧[18]研究表明，有机酸对肠道组织结构细胞的生长具有促进作用，由于有机酸降低了胃肠道的pH，维持肠道的稳态.本试验在饮用水中添加MFALA可显著提高黄羽肉鸡空肠的绒毛高度及绒毛高度与隐窝深度的比值，此结果与上述研究结果相似.Giridhar et al[19]研究显示，LA与海藻酸钠混合在强酸条件下交联减少，吸水率和降解速度降低，表明此类混合物有作为药物运输载体的潜力.LA可能会起到类似增塑剂的效果，使FA的结构更加稳定，降低FA的腐蚀性对肉鸡肠道的伤害.本试验结果表明，MFALA能促进黄羽肉鸡空肠绒毛的生长，进而促进营养物质的消化吸收，而Ⅲ和Ⅳ组肉鸡空肠的结构指标与Ⅰ组的差异不显著，可能是MFALA超过了饮用水最佳的添加量，此结果与“在日粮中添加1%FA对肉鸡肠道没有产生有益影响”的结论[17]一致.这可能是高浓度的FA在调节肉鸡肠道菌群的同时，也对肠道产生了腐蚀伤害.

3.3 MFALA对黄羽肉鸡空肠紧密连接蛋白的影响

紧密连接蛋白是多种蛋白相互作用形成的复合结构蛋白[20]，其主要功能是调控细胞内外物质的进出，有效防止肠道内细菌和毒素等有害物质进入细胞内，维持上皮屏障功能的完整[21].occludin和claudin-1为紧密连接蛋白中的主要跨膜蛋白.claudin-1蛋白主要起细胞信号转导的作用并调节细胞连接处选择渗透性[22]；occludin蛋白在细胞膜上分布最广，在细胞间主要发挥粘附分子的作用，具有维持和调节紧密连接蛋白的屏障功能[23].本试验通过测定黄羽肉鸡空肠中occludin和claudin-1基因的相对表达量来评价MFALA对空肠紧密连接蛋白的影响.

Matsuhisa et al[24]通过体外细胞试验发现，LA不仅能增强紧密连接蛋白的功能，而且能恢复由炎性细胞因子损伤的紧密连接蛋白屏障，此结果与本试验结果相符.本试验中，MFALA可显著上调肉鸡空肠occludin和claudin-1基因mRNA的相对表达量，这可能是由于幼龄黄羽肉鸡的肠道还未发育成熟，MFALA对肠道细胞的生长发育有促进作用，导致紧密连接蛋白基因的相对表达量上调.MFALA有助于加强肠道上皮机械屏障的作用，减少有害物质从肠道进入机体，从而促进黄羽肉鸡的生长.而Ⅲ和Ⅳ组肉鸡occludin和claudin-1基因mRNA的相对表达量与Ⅰ组相比差异不显著，可能是MFALA超过了饮用水最佳的添加量，FA在饮用水中的添加量超过了限度，会对肠道产生伤害，导致紧密连接蛋白基因的表达量没有显著上升.

3.4 MFALA对黄羽肉鸡空肠免疫因子的影响

肠道免疫能力是保障动物肠道健康的关键，可防止病原体和有害抗原通过肠道对机体健康造成影响[25].肠道免疫因子是评价肠道免疫能力的重要指标.本试验测定抗炎因子IL-4基因和促炎因子IL-6基因mRNA的相对表达量评价MFALA对黄羽肉鸡空肠免疫因子的影响.

研究表明：在日粮中添加0.5%复合有机酸+植物提取物显著降低断奶仔猪回肠IL-6和IL-12基因mRNA的相对表达量，复合有机酸+植物提取物似乎是通过减少促炎反应来提高免疫力而不是增强抗炎反应，从而正向调节肠道上皮的炎症应激[26]；在日粮中添加0.002%γ-羟基丁酸有调节肠道免疫的作用，可上调断奶仔猪回肠抗炎细胞因子IFN-γ、IL-4和IL-10基因的表达量[27]；在日粮中添加植酸钠可降低大鼠血清TNF-α和IL-6基因的表达量，并减轻大鼠由于高脂饮食引起的炎症反应[28].本试验结果与上述研究结果相似.本试验中，Ⅱ和Ⅲ组肉鸡空肠IL-4基因mRNA的相对表达量显著提高，Ⅱ和Ⅳ组肉鸡空肠IL-6基因mRNA的相对表达量降低，表明MFALA可能可以减少肉鸡肠道的应激反应，增强抗炎能力，从而增强机体免疫力.

4 结论

在饮用水中添加MFALA能改善黄羽肉鸡空肠的组织结构、紧密连接蛋白和免疫因子，提高黄羽肉鸡的生产性能，最适添加量为0.15%.