郭继倩,孙亦钊,付书娟,张思嘉,代俊俊,尹震花,陈 林

黄河科技学院 郑州市天然产物合成生物学重点实验室,郑州450063

补骨脂为豆科植物补骨脂Psoralea corylifolia L的干燥成熟果实,为传统中药[1]。按照《卫生部关于进一步规范保健食品原料管理的通知》(卫法监发〔2002〕51号)中执行,补骨脂为可用于保健食品的物品。现代研究表明,补骨脂含有香豆素类、黄酮类、单萜类等多种成分,显示出具有抗炎、抗菌、抗氧化、抗肿瘤、降血糖等多种功效[2-3]。关于补骨脂多糖的研究,目前仅国内几位学者对补骨脂不同产地多糖的含量及粗多糖的免疫活性进行了初步研究[4-7]。本课题组对补骨脂粗多糖的分离纯化、抗肿瘤活性及对RAW264.7巨噬细胞活力进行了研究[8-9],但超声波辅助提取补骨脂多糖工艺及抗氧化活性的研究还未见报道。

超声波提取可以提高被提取成分从固体中的溶出速率,提高提取效率。如能将补骨脂充分利用,快速、高效的生产出补骨脂多糖,对增加补骨脂的附加值具有积极的意义。因此,本研究采用超声波辅助从补骨脂中提取多糖,在单因素基础上通过正交试验对其提取工艺进行优化,进一步研究其抗氧化活性,为补骨脂的深加工和副产物(有机溶剂提取后残渣)的充分利用提供理论依据。

1 试剂与仪器

1.1 试剂

补骨脂(批号：170703),2018年9月购于河南省张仲景大药房,产地河南,经河南大学中药研究所李昌勤教授鉴定为豆科植物补骨脂Psoralea corylifolia L的干燥成熟果实,标本存于黄河科技学院天然药物研究室；石油醚、无水乙醇,天津市津东天正精细化学试剂厂；浓硫酸,开封方晶化工；苯酚,天津凯通化学试剂；ABTS,上海华蓝化学科技有限公司；DPPH,梯希爱上海化成工业发展有限公司；超纯水,实验室自制。

1.2 仪器

HK-10B 500g摇摆式粉碎机(广州市旭朗机械设备有限公司)；KQ-500DE数据控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；BSA224S电子天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)；En Vision多标记微孔板检测系统(美国Per Kin Elmer公司)。

2 方法与结果

2.1 补骨脂多糖提取工艺优化

2.1.1 葡萄糖标准曲线的绘制

准确称取105℃下干燥至恒重的葡萄糖标准品0.050 0 g,加适量蒸馏水溶解于50 m L容量瓶中,加蒸馏水至刻度线摇匀,制得质量浓度为1 mg/m L的葡萄糖标准储备液。精密量取葡萄糖标准储备液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 m L,分别置于50 m L容量瓶中,定容稀释,摇匀,备用。取不同质量浓度的稀释液各200μL于离心管中,加入200μL苯酚溶液摇匀,而后加入1 000μL浓硫酸,摇匀,在室温下静置30 min。冷却后,以蒸馏水代替葡萄糖做空白对照,用酶标仪于490 nm波长处测定吸光度。以吸光度为纵坐标,以葡萄糖标准溶液质量浓度为横坐标绘制曲线,计算出线性回归方程和相关系数：

式中,X为葡萄糖的质量浓度,Y为吸光度。结果表明,葡萄糖质量浓度在0.01～0.12 mg/m L范围内与吸光度线性关系良好。

2.1.2 补骨脂总多糖含量测定

补骨脂粉碎后用适量的石油醚脱脂3次,每次3d；残渣挥发干石油醚,用适量的乙醇(体积分数70%)室温浸提4次,每次2 d；补骨脂残渣自然阴干,储存备用。准确称取1.000 g预处理后的补骨脂残渣,超纯水作为溶剂,以一定液料比,在一定超声功率、超声时间及温度下提取多糖,提取2次,趁热减压抽滤,合并滤液；滤液与Sevage试剂混合,磁力搅拌30min后离心(4 000r/min,8min),取上清液,即得到脱蛋白的粗多糖溶液。准确定容实验所得粗多糖溶液至150 m L容量瓶中,超纯水定容；准确移取溶液200μL,依据苯酚-硫酸法测得吸光度,代入标准曲线算出粗多糖的百分含量,再由式(1)算出多糖的得率,平行3次,取平均值。

式中：C为粗多糖溶液的浓度,mg/mL；V=150 mL为多糖定容的体积；N为稀释倍数；M为预处理后补骨脂的质量,g。

2.1.3 补骨脂多糖提取单因素试验

结合文献[10-13]查证,考查超声时间、料液比、温度和超声波功率对补骨脂多糖提取的影响。

1)料液比。固定超声波功率为400 W,超声时间为30 min,温度为70℃,考察不同料液比(20 m L∶1 g、30 m L∶1 g、40 m L∶1 g、50 m L∶1 g和60 m L∶1 g)对补骨脂多糖得率的影响。结果(图1)显示,液料比对补骨脂多糖得率有一定影响。随着料液比增加,多糖得率先增大后下降；当料液比30 m L∶1 g时,多糖得率达到最高,为2.19%；当液料比大于30 m L∶1 g时,多糖得率逐渐下降。这可能是因为当提取溶剂增加时,对于一定量的补骨脂残渣粉末与水的接触面积增加,有利于多糖溶出。当水量过多时,水会吸收超声波的辐射,从而使细胞破壁作用降低,多糖得率趋于缓慢。料液比选择30 m L∶1 g为宜,选择料液比20 m L∶1 g、30 m L∶1 g和40 m L∶1 g三个水平做正交实验。

图1 料液比对多糖得率的影响

2)超声波功率。固定料液比为30 m L∶1 g,超声时间为30 min,温度为70℃,考查不同超声波功率(200、250、300、350、400 W)对补骨脂多糖得率的影响。结果(图2)显示,超声波功率对补骨脂多糖得率有一定影响。随着超声波功率的增强,补骨脂多糖得率逐渐增加；当超声波功率增加到350 W,多糖得率达到最高,为2.36%；继续增强功率,多糖得率逐渐下降。这可能由于在其他条件不变的情况下,超声波功率越高,超声波在水介质中产生的空化效应和机械波动效应对细胞壁的破坏作用就越大,多糖就越容易溶解析出,然而当超声波功率过高时,可能会使多糖降解,得率下降。故超声波功率比选择为350 W左右为宜,选择超声波功率250、300、350 W三个水平做正交实验。

图2 超声功率对多糖得率的影响

3)超声时间。固定料液比为30 m L∶1 g,超声波功率为350 W,温度为70℃,考查不同超声时间(20、25、30、35、40 min)对补骨脂多糖得率的影响。结果(图3)显示,超声时间对补骨脂多糖得率有一定影响。当超声时间低于30 min时,补骨脂多糖得率随超声时间的增加先下降后增加；超声时间为30 min时,多糖得率达到最大,为1.89%；继续增加超声时间,多糖得率下降。这说明了多糖提取过程与超声波处理时间密切相关,超声波提取时间短,多糖不能充分溶出；处理时间过长,可能使多糖结构破坏,得率也下降。因此,超声时间选择30 min为宜。选择超声时间30、35、40 min三个水平做正交实验。

图3 超声时间对多糖得率的影响

4)温度。固定料液比为30 m L∶1 g,超声波功率为350 W,超声时间为30 min,考查不同提取温度(40、50、60、70、80℃)对补骨脂多糖得率的影响。结果(图4)显示,温度对补骨脂多糖得率有一定影响。多糖得率随着提取温度的增加而逐渐增加；当温度为80℃时,多糖得率达到最大,为2.09%；温度越高,多糖溶解析出越充分,但是温度过高会导致多糖的部分降解,导致多糖得率下降。考虑到仪器的承受能力以及客观的现实耗能情况等,温度选择80℃为宜,选择温度60、70、80℃三个水平做正交实验。

图4 温度对多糖得率的影响

2.1.4 正交实验设计

采用SPSS 19.0软件,在单因素试验基础上,依据单因素试验结果设置水平,以超声时间、料液比、温度、超声波功率4个因素的3个水平设计正交实验L9(34)优化超声波辅助提取补骨脂多糖的工艺。因素水平表见表1,正交试验结果与分析见表2,方差分析见表3。

从表2的极差分析可知,影响补骨脂多糖得率的因素主次顺序为料液比(B)、温度(C)、超声时间(A)、超声波功率(D),最优的参数组合为A2B1C3D3,即超声时间为35 min,料液比为20 m L∶1 g,温度为80℃,超声波功率为350 W。

表1 正交试验因素水平表

表2 正交试验结果

表3 方差分析

由表3方差分析可知,在超声波辅助提取补骨脂多糖工艺正交实验所选择的因素和水平范围内,料液比和温度对补骨脂多糖的得率有极显著影响(P＜0.001),超声时间对多糖的得率有非常显著影响(P＜0.01),而超声波功率对多糖的得率影响不大(P＞0.05),方差分析结果与直观分析结果一致。

2.1.5 验证试验

正交实验验证实验结果显示,以超声时间为35 min、料液比为20 m L∶1g、温度为80℃、超声波功率为350W的参数进行提取,得率均值为2.35%(n=6),说明优化后的提取工艺参数,使多糖得率显著提高。

2.2 抗氧化活性测定

2.2.1 清除DPPH自由基能力的测定

参考文献[14]方法,测定补骨脂多糖对清除DPPH自由基的清除率,按公式(2)计算DPPH自由基清除率。每份样品平行操作3次,取平均值。

式中,Acontrol为DPPH本身在测定波长的吸收度,Asample为样品对DPPH作用后的吸收度数值(除去样品自身吸收)。

补骨脂多糖对DPPH自由基的清除能力见表4。结果显示,在初始浓度下,补骨脂多糖对DPPH自由基的清除率为13.26%,低于50%,未进一步的研究。

表4 补骨脂多糖对DPPH和ABTS自由基清除活性

2.2.2 清除ABTS自由基能力的测定

参考文献[15]方法,测定补骨脂多糖对清除ABTS自由基的清除率,按公式(3)计算ABTS自由基清除率。每份样品平行操作3次,取平均值。

式中,Acontrol为ABTS自由基本身在测定波长的吸收度,Asample为样品对ABTS自由基作用后的吸收度数值(除去样品自身吸收)。

补骨脂多糖对ABTS自由基的清除能力见表4。可以看出,在初始浓度下,补骨脂多糖对ABTS自由基的清除率为52.92%,对ABTS自由基的清除率大于50%。为了进一步研究浓度与清除率的关系,对多糖进一步稀释,测定半数抑制率。在实验浓度范围内,补骨脂多糖对ABTS自由基清除率与浓度呈正量效关系(图5),多糖浓度(X)与清除率(Y)的回归线性方程和相关系数为：

图5 补骨脂多糖质量浓度与ABTS自由基清除率关系

表明,随着浓度增加,其对ABTS自由基清除率也随之增大(IC50=88.39μg/m L)。

3 讨论

本研究在单因素实验基础上,采用正交实验法优化了超声波辅助提取补骨脂多糖工艺条件。确定了最佳提取工艺：超声时间为35 min,料液比为20 m L∶1 g,温度为80℃,超声波功率为350 W。在优化工艺下,补骨脂多糖的得率为2.35%。孙玲[4]采用90℃水提醇沉法提取产于不同产地的补骨脂中的多糖,结果显示,不同产地的补骨脂中多糖的含量在0.41%～1.26%,其中以安徽、河南(鲁山县)两个产地的补骨脂中多糖含量最高,达到了1.26%和1.13%；李发胜等[7]等采用沸水提醇沉法提取购买于大连国药大药房的补骨脂中的多糖,结果显示,多糖的含量达到3.84%。本文采用超声波辅助提取产于安徽的补骨脂多糖,多糖的得率达到了2.35%。可见,补骨脂多糖的含量具有地域性差异引起,而且与水浸提法相比,采用超声波辅助提取补骨脂中的多糖可明显的缩短提取时间,提高提取效率。

补骨脂多糖对ABTS自由基具有较强的清除能力,对DPPH自由基的清除能力较弱。可能是因为补骨脂多糖不能提供一个电子使其与DPPH的单电子配对[16]。另外,多糖的抗氧化活性与其结构有关,如糖链结构、分子量大小、单糖组成等[17],对补骨脂多糖进行分离纯化及构效探讨将有助于促进补骨脂的开发利用。本研究为补骨脂多糖的进一步开发利用提供了重要依据。