张泓欣, 艾菊, 罗威, 高冬丽

(云南师范大学 云南省马铃薯生物学重点实验室，云南 昆明 650500)

果实形状是重要的外观品质和育种目标.作为研究果实形状的模式作物，番茄具有圆形、椭圆形和梨形等多样性的果实形状.番茄的果实发育分为四个主要时期：坐果期、细胞分裂期、细胞体积扩展期和成熟期[1]，其中细胞分裂主要是通过有丝分裂来实现的.目前已经克隆调控番茄果形的多个基因，其中OVATE和sov1(suppressor of ovate)均属于OFP(Ouate Family Protein)家族基因[2-3].

OFP调节了植物生长和发育的很多方面.目前报道的OFP蛋白的功能包括调节果实和种子形状[2-4]、参与调节次生细胞壁的形成[5]、参与维管束的形成[6]、参与胁迫响应[7]以及参与激素信号途径等[8].OFP20是调控番茄果实和马铃薯块茎形状的调控因子[3].通过酵母双杂发现，SlOFP20与TONNEAU1 Recruiting Motif(TRM)家族的多个蛋白互作[3].TRM、TON1以及以FASS/TON2蛋白作为调节亚基的PP2A全酶组成了复合体[9].该复合体参与有丝分裂早前期分裂带的形成过程，在空间上控制细胞的分裂位置，其中TRM蛋白负责将PP2A定位在微管上，TON1对于复合体的组装起辅助作用，FASS/TON2参与底物选择及细胞定位[10].在拟南芥中，TRM家族有34个成员，但其功能可能不同.对AtTRM1的研究表明，AtTRM1的C端能够与TON1相互作用，并将TON1定位在微管上[11].

鉴于OFP20能够与TRM互作，而TRM又能与TON蛋白互作，那么OFP20是否有可能与TON互作仍旧是一个未知的问题.在前期研究中，我们通过图位克隆获得了StOFP20的序列，本研究明确了StOFP20及家族其他成员的表达模式，并利用拟南芥的TON蛋白找到了番茄和马铃薯的TON同源蛋白，进一步通过酵母双杂验证了TON是否与OFP20有互作关系.

1 材料与方法

1.1 基因的表达分析

在http://bar.utoronto.ca/efp_potato/cgi-bin/efpWeb.cgi网站上获得除StOFP外其他OFP基因的表达模式,单位是每千个碱基的转录每百万映射读取的reads(Fragments Per Kilobase Million，FPKM) .因为StOFP20在DM中是缺失的，因此没有从该网站上获得其表达模式.根据实验室已有的RH89-039-16的转录组数据，获得StOFP20在各组织的表达模式，单位是每千个碱基的转录每百万映射读取的Transcripts (Transcripts Per Kilobase Million,TPM).

1.2 基因克隆

以拟南芥中TON1和FASS/TON2的蛋白序列为query，在https://solgenomics.net网站上进行蛋白序列比对，比对参数为默认参数，在基因序列号后的括号内表明了与query的相似度.基因的扩增采用 GXL 高保真酶(Takara),扩增引物见表1.

表1 酵母双杂交所用引物

1.3 进化树分析

序列多重比对和构建系统进化树分别采用ClustaW和Mega7.进化树构建采用Neighbor-joining方法，自展值设置为1 000，其他参数均为默认参数.

1.4 酵母双杂交

分别以151高代植株的cDNA和番茄的cDNA进行PCR扩增，引物序列如表1所示.采用EcoRI和BamHI对pGBKT7和pGADT7进行双酶切，对StOFP20也进行酶切，使用T4连接酶连接，其余的基因通过IN-fusion连接，将连接产物转化至大肠杆菌DH5α菌株，对得到的单克隆进行聚合酶链式扩增反应(PCR)鉴定，送至昆明擎科生物进行测序.对所得的测序结果使用DNAMAN8软件进行分析.

使用聚乙二醇/醋酸锂(PEG/LiAc)法转化酵母Y2HGold菌株.实验组为pGBKT7-StOFP20和pGADT7-AD-StTON1,pGBKT7-SlOFP20和pGADT7-AD-TRM5，pGADT7-AD-SlTON1，pGADT7-AD-SlTON2，pGADT7-AD-SlTON3，以pGADT7+ pGBKT7-53共转化作正对照，以pGADT7和pGBKT7-Lam共转化作负对照.为了检测诱饵蛋白基因的自激活活性，以pGBKT7-StOFP20、 pGBKT7-SlOFP20载体与pGADT7-AD空载体共转化.将转化后的酵母分别取100 μL和200 μL涂布在SD-Leu-Trp(二缺)和SD-Leu-Trp-His(三缺)平板培养基上，放置30 ℃培养箱中培养3～5 d.如果在SD-Leu-Trp-His三缺平板上有菌落，挑取单菌落至YPDA+ABA液体培养基中振荡培养约24 h，取2 μL菌液并分别划在SD-Leu-Trp-His+ABA平板培养基上，在30 ℃培养箱中培养2 d，相机拍照后记录结果.实验重复2次.

2 研究结果

2.1 StOFP20的表达分析

RH89-039-16是一个二倍体马铃薯材料，其基因组和转录组均可在马铃薯的公共数据库中查询得到,但是由于StOFP20在DM中是缺失的，所以该基因在DM和RH89-039-1的公共数据库中都查询不到.根据实验室已有的RH89-039-16转录组，获得了StOFP20的表达模式(图1).StOFP20在根、茎、叶、花、匍匐茎及薯块中都有表达，其中在花药中的表达量最高.此外，由于OFP成员广泛参与植物的生长发育，因此也调查了其他成员的表达模式.Liu等的文章中提供了25个含有OVATE结构域的基因序列号[12]，其中有2个序列号是基因的不同转录本，去掉这2个序列号，对剩下的23个基因在根、叶、花、匍匐茎、早期薯块及成熟薯块的表达量进行了分析(图2).结果表明，大部分基因的表达量都较低，其中有4个基因在各个组织的FPKM值均为0，部分基因倾向于在个别组织高表达，如PGSC0003DMT400011286在根中高表达，PGSC0003DMT400050511在叶中高表达，PGSC0003DMT400033048在花中高表达，PGSC0003DMT400042334 和PGSC0003DMT400072347在匍匐茎中高表达.

图1StOFP20的表达模式 图2 二倍体马铃薯RH89-039-16中OFP成员的表达模式

Fig.1 The expression pattern ofStOFP20 Fig.2 The expression pattern ofOFPgene family members in diploid potato material RH89-039-16

2.2 马铃薯和番茄TON基因的克隆

图3 四个物种中TON蛋白的聚类分析Fig.3 Phylogenetic analysis of TON proteins in four species

拟南芥中有3个TON基因，分别是TON1A(At3g55000)、TON1B(At3g55000)和TON2(At5g18580).通过在Sol Genomics Network搜索，在番茄中找到5个同源基因，分别为Solyc04g049710(70.23%)、Solyc04g009550(68.58%)、Solyc01g067500(91.67%)、Solyc04g010070(26.06%)和Solyc05g054980(24.86%)，其中后两个基因的同源性低，没有进行后续分析.在马铃薯中找到一个同源基因Sotub04g009490(69.73%).玉米中TON的同源基因add1和dcd1功能已经明确[13].对拟南芥、马铃薯、番茄和玉米中的TON蛋白进行聚类(图3)，可分为TON1和TON2两类.根据聚类结果，分别将Solyc04g049710、Solyc04g009550、Solyc01g067500和Sotub04g009490命名为SlTON1A、SlTON1B、SlTON2和StTON1.

2.3 酵母双杂交

Wu等的研究表明，SlOFP20与SlTRM5互作[3].研究以这2个互作蛋白为对照，验证OFP20与TON的互作关系.实验结果表明，SlOFP20与SlTRM5能够在SD-Leu-Trp-His+ABA平板上生长，即SlOFP20与SlTRM5互作，但SlOFP20与SlTON1A、SlTON1B、SlTON2共转化后均不能在SD-Leu-Trp-His平板上生长，StOFP20与StTON1共转化后也不能在三缺板上生长，说明在番茄和马铃薯中，OFP20与鉴定出的TON基因没有互作关系(图4).

A为SlOFP20与SlTRM5的共转化;B为SlOFP20与 SlTON1A的共转化,其中左图为共转化在二缺板上的生长，右图为共转化在三缺板上的生长.OFP20与其他TON蛋白的共转化情况与B图类似，没有展示

图4 OFP20与TON的酵母双杂交

Fig.4 Yeast two-hybrid assay between OFP20 and TON

3 讨 论

OFP20不仅调控番茄果实形状，同时也是马铃薯块茎形状的调控因子，因此解析OFP20的调控机理具有非常重要的意义.在番茄中，SlOFP20在各个组织都有表达，在梨形果实植株中的表达高于圆形果实植株中的表达[3].不同于SlOFP20表达量的差异，StOFP20在圆形薯形的植株中能够扩增，在长形薯形的植株中缺失[3].StOFP20在各组织都表达，与SlOFP20的表达模式一致(图1).马铃薯OFP家族的其他成员表达水平存在着不同的转录表达形式，暗示着OFP基因可能具有不同的功能(图2).

TRM与TON组成的复合体调控细胞的分裂位置.拟南芥TRM基因过表达后导致叶片、花器官及角果均变长[14].拟南芥TON突变后导致幼苗发育不良，细胞伸长异常，该表型主要是由于早期分裂带消失造成的[9]. 对SlOFP20突变体的子房进行细胞学观察，发现子房的细胞数量发生了变化，可能是由于子房发育过程中细胞分裂异常导致的.由于SlOFP20与TRM互作时会发生定位转移，因此，Wu等推测OFP-TRM蛋白复合体在细胞质和微管的动态定位调控了细胞分裂，进而影响了番茄果实形状[3].本研究发现OFP20与TON没有互作，暗示着TON不参与SlOFP20-TRM复合体的形成以及该复合体对果实形状或块茎形状的调控.

马铃薯块茎的发育受赤霉素和细胞分离素等多种激素的调控[15]，同时OFP蛋白参与激素信号途径也得到证实.Xiao等发现OsOFP1参与油菜素内酯的信号途径[8].Wang等利用染色质沉淀发现AtGA20ox1受AtOFP1的直接调控，AtGA20ox1是赤霉素合成的一个关键基因[16].因此StOFP20是否也通过激素信号途径调控薯形还需进一步研究.