龚英， 陈继平， 陈汉菊， 张海霞， 孙琪

(云南师范大学 化学化工学院，云南 昆明 650500)

天然橡胶胶乳是一种天然高分子混合物，由聚异戊二烯(25%～35%)、蛋白质(1%～1.8%)、碳水化合物(1%～2%)、脂类化合物(0.9%～1.7%)、无机成分(0.4%～0.6%)、氨基酸(0.4%)和水(50%～70%)组成.天然橡胶具有优良的回弹性、绝缘性、隔水性及可塑性，应用领域广泛[1].在过去的15年间，全球天然橡胶的产量和需求量双双增长，由此带来的天然橡胶废弃物的处置和降解问题也引发学者的广泛关注.虽然微生物能分解天然橡胶中的蛋白质[2-3]，但是自身难降解的天然橡胶聚异戊二烯分子仍带来了废弃物管理方面的挑战[4].

研究发现，一些特殊来源的微生物对于天然橡胶具有一定的生物降解作用，例如从废水处理厂污泥中分离的放线菌能在天然橡胶液体培养基中生长，并降低天然橡胶的分子量[5]；从橡胶种植土壤中分离出的Gordoniapolyisoprenivoransstrains[6]和放线菌[7]对于胶乳具有降解作用；利用产黄青霉分泌的虫漆酶和锰过氧化物酶能生物降解橡胶[8].寻找来源广泛且质量安全的可降解橡胶的微生物成了研究的热点.

黑曲霉是一类广泛分布于自然环境、价廉且易培养的工业菌种[9]，能分泌酸性蛋白酶及纤维素酶等多种酶，被用来降解植物中没食子酸单宁[10]等成分.据此推测，黑曲霉菌具有降解天然橡胶中蛋白质及其他组分的潜力.研究将详细考察黑曲霉菌对天然橡胶的降解能力，为天然橡胶的生物降解提供一些参考.

1 实验部分

1.1 实验材料

黑曲霉菌种(ATCC10582)、改良马丁培养基和琼脂购自上海通派生物科技有限公司.一次性天然橡胶手套为桂林紫竹乳胶制品有限公司生产.泰国三棵树天然橡胶胶乳购自东莞成一橡胶有限公司.

1.2 实验步骤

1.2.1 菌种的复苏和复壮

向黑曲霉干菌种(0代)中加入0.5 mL灭菌的改良马丁液体培养基，制成菌悬液，然后将菌悬液转入装有50 mL灭菌的改良马丁液体培养基的摇瓶中，在28 ℃摇床震荡培养5 d，得到复苏的黑曲霉菌(1代).然后将黑曲霉孢子悬液加入改良马丁琼脂平板培养基表面复壮，在28 ℃恒温恒湿箱中培养5 d，得到复壮的黑曲霉菌(2代，图1).收集黑曲霉菌，用灭菌的蒸馏水制成菌悬液，置于4 ℃保存，用于后续的天然橡胶降解实验.采用稀释平板菌落计数法(图2)，测得菌悬液中黑曲霉菌数量为72 000 CFU/mL.

图1 改良马丁琼脂培养基上复壮的黑曲霉菌 图2 稀释平板法培养的黑曲霉菌

Fig.1 The rejuvenation ofAspergillusnigerusing modifiedMartinagarmedium Fig.2 The cultivation ofAspergillusnigerbydilutionplatemethod

1.2.2 天然橡胶样品的准备

天然橡胶样品有两种，分别取自天然橡胶手套掌心位置的样品和利用天然橡胶胶乳在50 ℃干燥后自制的橡胶膜.这两种橡胶膜样品的大小均为5 cm×5 cm，厚度均为0.5 mm.

1.2.3 天然橡胶的降解实验

天然橡胶的降解实验分为两部分.

第一部分：根据正交试验法，设计黑曲霉单一菌种溶液对天然橡胶的降解实验，考察的因素和水平如表1所示.将橡胶样品用细绳串在一起，然后浸入黑曲霉菌溶液中，在规定的温度和pH值条件下降解30 d.每隔10 d更换一次黑曲霉菌溶液.根据公式(1)计算橡胶膜的质量损失率，以此为据优化降解条件.每个实验条件做三个平行样，取平均值为实验结果.

质量损失率(%)=

(1)

表1 正交试验的因素和水平

第二部分：在优化的降解实验条件下，开展天然橡胶样品的黑曲霉菌降解实验，降解时间为60 d.每隔10 d更换一次黑曲霉菌溶液，并取出三块样品，观察橡胶样品的表面，测定橡胶样品的质量损失率，取平均值为实验结果.

1.3 天然橡胶交联密度的测定

采用甲苯溶胀法测定天然橡胶的交联度.取一定体积的降解前或降解后膜样品，浸入30 ℃甲苯中72 h直至膜样品完全膨胀.然后除去甲苯，测量膜样品的体积，根据Flory-Rehner方程[11-12]，计算橡胶样品的交联密度.

其中，ve为天然橡胶的交联密度；vr为膜样品完全膨胀后体积分数；Vs为甲苯溶剂的摩尔体积，105.91cm3/mol；x为天然橡胶和甲苯溶剂的相互作用参数，0.43.

2 结果与讨论

2.1 黑曲霉菌降解实验条件的优化

采用极差法分析正交试验的结果.天然橡胶膜和天然橡胶手套的降解实验结果分别如表2和表3所示.两类橡胶样品的最大质量损失率分别为4.5%和2.3%，并且降解实验的影响因素主次关系均是温度影响最大，其次是pH值，接着是黑曲霉菌浓度和通气量.对于两类橡胶样品，正交试验所获得的优化实验条件均为A2B3C3D2，即降解温度为32 ℃，pH值为6，黑曲霉菌浓度为1 500 CFU/mL，通气量为15 L/min.

表2 天然橡胶膜降解正交试验的结果

表3 天然橡胶手套降解正交试验的结果

2.2 优化条件下天然橡胶的降解

在优化条件下开展天然橡胶膜和天然橡胶手套的降解实验，结果如表4所示.经过30 d的降解，天然橡胶膜和天然橡胶手套的质量损失率分别为4.9%和2.7%，略高于正交试验中测得的最高质量损失率.经过60 d的降解，天然橡胶膜和天然橡胶手套的质量损失率分别达到6.2%和3.4%.根据天然胶乳的组成特点分析可知，不仅天然橡胶中蛋白质、碳水化合物、脂类化合物、氨基酸等这些易于降解的组分发生了降解，聚异戊二烯橡胶烃也开始发生降解.降解后橡胶膜表面照片如图3和图4所示.降解后橡胶膜的表面出现了小孔，并且随着降解时间的延长，孔洞数量和尺寸不断增加，说明天然橡胶中聚异戊二烯橡胶烃发生了持续降解.

表4 优化条件下降解实验结果

20 d 40 d 60 d

图3 天然橡胶膜的降解图片

Fig.3 The degraded natural rubber films

20 d 40 d 60 d

图4 天然橡胶手套的降解图片

Fig.4 The degraded natural rubber gloves

2.3 讨 论

交联密度反映了橡胶交联键的多少.在优化条件下，经过60 d降解后，天然橡胶膜和天然橡胶手套的交联密度如表5所示.降解后，天然橡胶膜和天然橡胶手套的交联密度分别降低了29.4%和9.3%，说明黑曲霉菌破坏了天然橡胶中部分交联键，有助于天然橡胶的进一步降解.

表5 交联密度测定结果

从质量损失率、膜表面孔洞及交联密度这些变化可知，黑曲霉菌对自制的天然橡胶膜的降解作用明显强于天然橡胶手套.自制的天然橡胶膜仅含有天然橡胶胶乳组分，且通过低温干燥制备，橡胶烃分子的交联程度较低.天然橡胶手套中含有硫化剂等组分[13]，交联程度更高.据此推测，黑曲霉菌对交联程度较低的天然橡胶膜的降解能力更强.建议在制备天然橡胶制品时，经过适当程度的交联处理能满足天然橡胶的应用要求即可.这样，不过度交联的天然橡胶分子将更有利于后续橡胶废弃物的生物降解处理.

3 结 语

黑曲霉菌对天然橡胶中多种组分均具有良好的降解作用，能破坏天然橡胶中的交联键，并在膜表面形成孔洞，以促进天然橡胶的生物降解.采用正交试验法，优化的天然橡胶降解条件如下：降解温度为32 ℃，pH值为6，黑曲霉菌浓度为1 500 CFU/mL，通气量为15 L/min.