李千会，陈说，赵杨

（中国医科大学附属第一医院妇科，沈阳 110001）

卵巢癌是最致命的女性生殖系统恶性肿瘤，死亡率较高［1］。卵巢癌在早期阶段没有明显症状，因此，大多数患者在初诊时已处于晚期［2］。肿瘤切除手术联合铂类药物化学治疗（简称化疗）可用于多种实体肿瘤的治疗。顺铂自1989年开始被广泛用于治疗卵巢癌，但许多患者可出现顺铂耐药及肿瘤复发，且顺铂耐药的具体机制目前尚不明确［3］。E2F转录因子1（E2F transcription factor 1，E2F1）属于E2F转录因子家族，参与多种肿瘤的发生、发展和耐药［4-7］。本研究组在前期研究［8］中发现，E2F1可通过调节miR-519d/RhoC途径促进卵巢癌的发生和发展。然而，E2F1是否参与卵巢癌耐药尚未见文献报道。因此，本研究拟探讨E2F1在卵巢癌细胞耐药中的作用及其可能的机制。

1 材料与方法

1.1 细胞培养和转染

用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素的DMEM培养基（美国HyClone Logan公司）培养人卵巢癌细胞株A2780。另用含20 ng/mL顺铂的DMEM培养基培养人卵巢癌顺铂耐药株A2780/DDP。在常规培养期间，每2 d更换1次培养基。按照说明书用lipofectamine 3000（美国Invitrogen公司）进行细胞转染，分别用E2F1过表达质粒及小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）转染A2780/DDP细胞，上调或下调E2F1的表达。

1.2 MTT

将细胞消化后接种于96孔板中（3×103/孔），孵育12 h，加入不同浓度的顺铂。待细胞培养48 h后加入5 mg/mL MTT（中国Solarbio公司）20 μL/孔，37 ℃孵育4 h，除去培养基/MTT溶液，加入DMSO（150 μL/孔）。使用微孔板分光光度计（美国Bio-Tek Instruments公司）测量吸光度。

1.3 RT-PCR

用TRIzol试剂盒（日本TaKaRa公司）从A2780、A2780/DDP及分别转染了E2F1过表达质粒和si-RNA的A2780/DDP细胞中提取总RNA，按照说明书逆转录cDNA。基于GenBank序列设计引物。使用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒（日本TaKaRa公司）进行RT-qPCR扩增。GAPDH用作内参基因。E2F1引物序列如下：F，5'-AACCGCTGTTGTCCCG-3'；R，5'-CAAGCCCT GTCAGAAATCC-3'。GAPDH引物序列如下：F，5'-A GCCTCAAGATCATCAGCAATG-3'；R，5'-CACGAT ACCAAAGTTGTCATGGAT-3'。

1.4 Western blotting

变性蛋白（40 μg）上样，10%或15%SDS-PAGE凝胶电泳分离，转移至Hybond膜（德国Amersham公司），于3%牛血清白蛋白中37 ℃封闭2 h。加入一抗［E2F1抗体1︰1 000稀释、自噬相关蛋白7（autophagy related 7 homolog，ATG7）抗体1︰1 000稀 释、死骨片蛋白（sequestosome 1，P62/SQSTM1）抗体1︰1 000稀释、自噬相关蛋白10（autophagy related 10 homolog，ATG10）抗 体1︰1 000稀 释，美国Proteintech公司；切除修复交叉互补蛋白1（excision repair cross-complementing group 1，ERCC1）抗体1︰300稀释、ATP结合蛋白C1（ATP-binding cassette，sub-family C member 1，ABCC1）抗 体1 ︰300稀释、ATP结合蛋白G2（ATP-binding cassette subfamily G member 2，ABCG2）抗体1︰300稀释，中国北京Bioss公司；微管相关蛋白1轻链3（microtubuleassociated protein 1 light chain 3 beta，LC3）抗体1︰1 000稀释，美国 Cell Signaling Technology公司］，4 ℃孵育过夜。TBST洗膜10 min×3次，加入抗小鼠/兔IgG抗体（1︰5 000，美国Proteintech公司），室温下孵育2 h，洗膜10 min×3次。ECL Plus检测显影。β-actin（1︰3 000稀释，美国 Proteintech公司）用作内参照。

1.5 免疫荧光染色

在培养板中将融合度达到 60%～80%的细胞爬片用PBS浸洗5 min×3次。4%甲醛固定30 min。PBS洗涤3次，0.2%Triton X-100室温下透化30 min。PBS洗涤3次，3%BSA 室温下封闭30 min。加入一抗ATG7（1︰100稀释）、ATG10（1︰100稀释）、LC3（1︰100稀释）、P62（1︰100稀释），4 ℃孵育过夜。PBS洗涤3次，加入TRITC标记的二抗，室温下暗箱中孵育2 h，洗涤，DAPI孵育5 min，PBS洗涤。荧光显微镜下拍照。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 A2780/DDP细胞中E2F1表达水平高于A2780细胞

MTT检测结果显示，卵巢癌细胞系顺铂耐药株A2780/DDP（IC50：26.5 μmol/L）对顺铂的耐药性高于亲本A2780细胞（IC50：13.9 μmol/L），差异有统计学意义（P＜ 0.05），见图1A。

RT-PCR及Western blotting结果显示，A2780/DDP细胞中E2F1mRNA和蛋白质表达水平显著高于A2780细胞，差异有统计学意义（P＜ 0.05），见图1B、1C。

2.2 E2F1参与卵巢癌细胞耐药

通过转染E2F1过表达质粒或E2F1 siRNA，上调或下调A2780/DDP中E2F1的表达，并应用Western blotting 及RT-PCR检测转染效率。结果显示，转染E2F1过表达质粒后，A2780/DDP细胞中E2F1mRNA和蛋白表达水平显著升高（P＜ 0.05，图2A、2C）；在A2780/DDP细胞中转染E2F1 siRNA，E2F1mRNA和蛋白表达水平显著降低（P＜ 0.05，图2B、2D）。

图1 A2780/DDP细胞中E2F1mRNA和蛋白表达水平高于A2780细胞Fig.1 E2F1mRNA and protein were expressed at higher levels in cisplatin-resistant ovarian cancer cell line A2780/DDP than parental A2780

图2 E2F1过表达质粒/E2F1 siRNA转染上调/下调了E2F1的表达Fig.2 Transfection of E2F1 overexpression plasmid or E2F1 siRNA upregulates or downregulates the expression of E2F1

MTT结果显示，E2F1的过表达降低了A2780/DDP细胞对顺铂的敏感性（P＜ 0.05，图3A）；沉默E2F1具有相反的作用（P＜ 0.05，图3B）。表明E2F1能增强卵巢癌细胞的顺铂耐药性。

2.3 改变 E2F1 表达不影响耐药相关蛋白的表达

Western blotting结果显示，A2780/DDP细胞中E2F1的过表达或低表达对 ERCC1、ABCC1或ABCG2的蛋白表达水平无显著影响（图4）。表明E2F1并非通过调节耐药相关蛋白增强卵巢癌细胞的顺铂耐药性。

2.4 E2F1通过调节自噬相关蛋白表达影响卵巢癌细胞耐药

本研究分别在A2780/DDP与A2780细胞中检测了自噬相关蛋白ATG7、ATG10、LC3、P62的表达水平。结果显示，与A2780细胞相比，A2780/DDP细胞中ATG7、ATG10和LC3蛋白表达水平升高，P62表达水平降低（图5）。提示自噬可能在卵巢癌细胞顺铂耐药中发挥作用。

用顺铂处理的A2780/DDP细胞中E2F1的过表达增加了ATG7、ATG10和LC3的表达，并降低P62表达；而E2F1的敲低具有相反的效果（图6）。这些结果证实，E2F1的过表达促进了A2780/DDP细胞中顺铂诱导的保护性自噬。

图3 E2F1参与卵巢癌细胞耐药Fig.3 E2F1 is involved in ovarian cancer cell resistance

图4 改变 E2F1 表达不影响耐药相关蛋白的表达Fig.4 Altering E2F1 expression does not affect the expression of proteins involved in drug resistance

图5 自噬相关蛋白在A2780/DDP与A2780中的表达Fig.5 Differential expression of autophagy-related proteins in A2780/DDP and A2780 cells

3 讨论

E2F1在肿瘤组织中过表达可促进卵巢癌的发生和发展［7］。本研究结果显示，顺铂耐药卵巢癌细胞系E2F1表达水平高于亲本卵巢癌细胞系，而且转染编码E2F1的质粒降低了A2780/DDP细胞对顺铂的敏感性，而沉默E2F1则具有相反的作用，表明E2F1参与了卵巢癌的顺铂耐药。

肿瘤细胞耐药性与耐药相关基因的表达水平相关。ERCC1参与某些癌症中顺铂抗性的发展［9-10］。乳腺癌耐药蛋白BCRP/ABCG2是ATP结合盒（ATPbinding cassette，ABC）家族中的药物转运蛋白，在化疗耐药中起着至关重要的作用［11-12］。ABCC1也称为多药耐药相关蛋白1（multidrug resistanceassociated protein 1，MRP1），与多种癌细胞系的耐药性相关［13-14］。本研究通过评估耐药相关基因的表达水平，探讨了E2F1增强卵巢癌耐药性的分子机制。结果显示，在A2780/DDP细胞中过表达或敲低E2F1后，ERCC1、ABCC1和ABCG2的表达水并无改变，提示这些蛋白可能并未参与 E2F1诱导的卵巢癌顺铂耐药。因此，E2F1可能通过调节其他基因促进卵巢癌顺铂耐药性。

图6 E2F1通过调节自噬相关蛋白表达影响卵巢癌细胞耐药Fig.6 E2F1 promotes cisplatin resistance in ovarian cancer cells by regulating the expression of autophagy-related proteins

越来越多的研究表明自噬在肿瘤耐药中起重要作用。自噬是一种进化上保守的过程，通过对长寿蛋白和功能失调细胞器的降解和更新提供代谢支持，以维持细胞稳态。自噬在细胞正常基础代谢水平持续发生，在应对饥饿、氧化应激或药物治疗等应激时上调［15］。肿瘤细胞可通过诱导自噬对抗肿瘤治疗药物产生耐药性［16-18］。LC3-Ⅱ是监测哺乳动物自噬和自噬相关过程的可靠标记［19］，P62（SQSTM1）累积表示对自噬体的清除被阻断。当LC3-Ⅱ上调时，P62下调，表明自噬正在进行，反之表示自噬过程被抑制［20］。ATG8和ATG12是形成自噬体所需的遍在蛋白样蛋白，ATG7是E1样连接酶，而ATG10是E2样连接酶，后二者对ATG12的缀合都是必需的。以上这些蛋白质的改变可导致自噬的丧失。在ATG8系统中，ATG12-ATG5缀合物能促进ATG8和磷脂酰乙醇胺之间的缀合，而ATG10以E3-酶非依赖性方式促进ATG12-ATG5缀合。增强的ATG7和ATG10水平足以诱导自噬［21］。本研究结果显示，与A2780细胞相比，顺铂耐药卵巢癌细胞系A2780/DDP中ATG7、ATG10、LC3表达水平升高，P62表达水平降低，提示顺铂耐药可能与A2780/DDP细胞中的自噬有关。研究［22-23］表明，E2F1通过参与相关的信号通路影响自噬。本研究发现，E2F1的过表达增加了ATG7、ATG10和LC3蛋白的表达，降低了P62的表达，而沉默E2F1则具有相反的效果。以上结果表明E2F1可能通过增加自噬导致卵巢癌细胞对顺铂的耐药。

综上所述，本研究表明 E2F1 可通过调节自噬相关蛋白，诱导卵巢癌细胞保护性自噬，并增强卵巢癌细胞对顺铂的耐药性。