梁雪亭，冯博

（中国医科大学附属第一医院放射科介入病房，沈阳 110001）

肝癌是最常见的消化道恶性肿瘤之一，具有病情进展快、恶性程度高、多发转移等特点，在中国乃至世界一直保持着较高的发病率与死亡率。据文献［1］报道，2015年中国肝癌的发病率及死亡率分别排在所有肿瘤中的第四名和第三名。尽管针对肝癌有多种治疗手段，但由于肝癌致病因素复杂，发生发展的分子机制尚不明确，仍然缺少有效的靶向治疗方式。

Myc target 1（MYCT1），也称MTLC，是最早在喉鳞状细胞癌中发现的一种与多种肿瘤发生发展相关的基因［2］。研究［3-4］表明，MYCT1参与调控肝癌组织中mRNA表达，且其中1个转录本MYCT1-TV参与调控Bel7402细胞增殖、凋亡和侵袭能力。有多种转录因子参与调控MYCT1基因，从而影响肿瘤发生发展。喉癌中，YY1直接抑制MYCT1基因表达，并抑制其在hep2细胞系中的抑癌作用［5］。同样，CREB可抑制喉癌中MYCT1基因的表达，并通过MYCT1/NAT10通路促进细胞迁移能力［6］。

CCAAT/增强子结合蛋白β（CCAAT/enhancer binding protein β，C/EBPβ）是转录因子CCAAT/增强子结合蛋白（CCAAT/enhancer binding proteins，C/EBPs）家族的重要成员，在炎症调控、细胞增殖、分化以及肿瘤发生发展等方面都起着重要的作用［7-9］。此外，C/EBPβ还可作为乙型肝炎病毒宿主因子，参与病毒复制和肝癌癌前病变过程［10］。然而，C/EBPβ在肝癌中的具体调控机制目前仍不清楚。本研究组通过Jasper等预测软件发现，MYCT1是C/EBPβ的靶基因之一。本研究拟探讨在肝癌SMMC7721细胞中敲减C/EBPβ对MYCT1表达的调控作用，以及MYCT1对细胞迁移功能的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞培养

人肝细胞癌细胞系SMMC7721购自中科院上海细胞库，在含有10%胎牛血清（美国Gibco公司）及双抗的1640培养基（美国Gibco公司）中，于37 ℃、5%CO2培养箱中孵育，1～2 d更换新鲜细胞培养基。当细胞长满瓶底后，用0.25%胰酶消化后进行传代培养。

1.2 基因瞬时转染

细胞转染前24 h接种至6孔板（2×105～3×105/mL）。待细胞成长至密度约为70%～80%时，采用jetPRIME转染试剂（法国Polyplus transfection公司）进行siRNAs（siMYCT1，siC/EBPβ）（上海生工公司）及各自对照组转染。6～8 h后更换细胞培养基，进行划痕实验，或继续培养48 h提取RNA和蛋白进行后续实验。

转染siRNA序列如下：siMYCT1，5'-GCUGUGA ACGUCGAAGCAATT-3'；siC/EBPβ，5'-CCCACGUG UAACUGUCAGCTT-3'。

1.3 实时qPCR检测

收集转染48 h后细胞，用RNA提取剂TRIzol（日本TaKaRa公司）提取总RNA，应用TaKaRa PrimeScript RT Master Mix Kit（Perfect Real Time）（日本TaKaRa公司）试剂盒将mRNA反转成cDNA。应用SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ（日本TaKaRa公司）进行实时qPCR检测。PCR体系及条件均依照说明书，以2-△△Ct法计算相对表达量，以GAPDH作为内参。

实验所需引物序列如下：MYCT1F 5'-ATGGCA ATCGGGCTGGTA-3'，R 5'-CTTGTCGCTGGAAGGT GA -3'；C/EBPβF 5'-CACAGCGACGACTGCAAGAT CC-3'，R 5'-CTTGAACAAGTTCCGCAGGGTG-3'；GAPDHF 5'-CATGTTCGTCATGGGTGTGAACC -3'，R 5'-GGTCATGAGTCCTTCCACGATACC -3'。

1.4 Western blotting

收集转染48 h后细胞，在含有PMSF（上海华舜公司）的RIPA裂解液（上海碧云天公司）中裂解细胞，并通过BCA蛋白测定试剂盒（上海碧云天公司）测定蛋白浓度。蛋白样品在12% SDS-PAGE上分离，通过湿转膜方式转移至PVDF膜（美国Millipore公司）。5%脱脂奶粉封闭2 h后，加入兔源MYCT1抗体（1︰300稀释，英国Abcam公司）或小鼠源GAPDH抗体（1︰2 000稀释，中国Proteintech公司），4 ℃封闭过夜。次日，洗膜后加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔/鼠二抗（1︰3 000稀释，中国Proteintech公司），37 ℃孵育1 h。TBST洗膜后，ECL（中国天根公司）发光，在暗室中通过化学发光成像分析系统进行曝光取图。

1.5 划痕实验

在6孔板中培养并转染细胞，6 h后在每孔中心用1 mL移液器枪头水平划痕，更换培养液，并于显微镜下拍照，记录划痕宽度。于24 h、48 h后分别更换培养液，并拍照，记录划痕宽度。汇总图片中划痕宽度，分析细胞迁移能力。

1.6 Transwell实验

在6孔板中培养并转染细胞，6 h后胰酶消化，使用双无培养基重悬细胞，分别向Transwell小室上室加入100 μL细胞悬液（5×105/mL），下室加入500 μL含10%血清的培养基，置于培养箱孵育。24 h后取出小室，4%多聚甲醛室温固定30 min，0.1%结晶紫溶液染色20 min，PBS冲洗小室上层，并用棉签擦拭小室上层细胞。用小刀剥下小室薄膜，薄膜下层朝上，中性树脂封片。干燥后，于显微镜下拍照取图分析。

1.7 统计学分析

使用SPSS 20.0软件，进行独立样本t检验，每组实验均重复3次，数据以表示。P＜ 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肝癌细胞中C/EBPβ对MYCT1的表达调控

通过实时qPCR检测SMMC7721细胞中siC/EBPβ和siMYCT1的转染效率，结果显示，siMYCT1转染组细胞中MYCT1mRNA水平较对照组显著降低（图1A，P＜ 0.05），siC/EBPβ转染组C/EBPβmRNA水 平较对照组显著降低（图1B，P＜ 0.05）。同时，通过在SMMC7721细胞中转染siC/EBPβ检 测C/EBPβ对MYCT1mRNA、蛋白水平的调控作用。实时qPCR结果显示敲减C/EBPβ组MYCT1mRNA表达水平较对照组显著提高（图1C，P＜ 0.05）；Western blotting结果显示，敲减C/EBPβ组MYCT1基因蛋白表达水平较对照组显著提高（图1D，P＜ 0.05）。以上结果提示，敲减C/EBPβ可显著提高MYCT1基因的表达。

2.2 C/EBPβ通过调控MYCT1的表达影响肝癌细胞迁移能力

图1 SMMC7721细胞siC/EBPβ、siMYCT1转染效率及siC/EBPβ对MYCT1基因表达的影响Fig.1 Transfection efficiency of siC/EBPβ and siMYCT1 in SMMC7721 cells and effect of siC/EBPβ on MYCT1 gene expression

通过对转染后的SMMC7721细胞进行划痕实验，检测敲减C/EBPβ对肝癌细胞迁移能力的影响。结果显示，在划痕形成的24 h以及48 h内，与对照组比较，转染siC/EBPβ的细胞迁移的距离显著减少，转染siMYCT1的细胞迁移的距离显著增多，共转染siC/EBPβ与siMYCT1可显著恢复siMYCT1对细胞迁移能力的影响（P＜ 0.05），见图2。Transwell实验结果显示，与对照组相比，转染siC/EBPβ细胞穿过薄膜的数量显著减少，转染siMYCT1细胞穿过薄膜的数量显著增多，共转染siC/EBPβ与siMYCT1则可显著恢复siMYCT1对细胞迁移能力的影响（P＜ 0.05）。见图3。

图2 迁移实验检测C/EBPβ对SMMC7721细胞迁移能力的影响Fig.2 The effect of C/EBPβ on SMMC7721 cell migration in a scratch assay

图3 Transwell实验检测C/EBPβ对SMMC7721细胞迁移能力的影响Fig.3 The effect of C/EBPβ on SMMC7721 cell migration in Transwell assay

3 讨论

自从在喉鳞状细胞癌中首次发现MYCT1基因后，MYCT1基因在其他癌症和疾病中的作用受到越来越多的关注。MYCT1基因在胃癌组织中下调并诱导胃癌细胞的凋亡［11］。最近，MYCT1基因过表达被证实可抑制急性髓系白血病细胞的增殖能力，并诱导其发生凋亡［12］。同时，高表达MYCT1的转录标记可用来表征evi1重组的急性髓系白血病，为白血病的治疗提供了新的思路。而在肝癌中的MYCT1相关研究较少见。本研究发现，敲减MYCT1可显著提高肝癌SMMC7721细胞的迁移能力，与早期研究［2-3］结果趋势一致。

C/EBPβ作为一种重要的转录因子，与肝癌的发生发展密切相关。研究［13-14］表明，C/EBPβ可通过上调肝癌中血清类黏蛋白2的表达抑制肿瘤转移，并与COX-2共表达，参与二乙基亚硝酸钠诱导的肝癌的发生。此外，C/EBPβ还可通过表观遗传的方式参与肝癌的进程，在肝癌早期发展过程中，C/EBPβ的低甲基化与致癌作用激活相关［15］。本研究中检测了肝癌细胞中C/EBPβ对MYCT1基因的调控作用，证实了敲减C/EBPβ可显著提高MYCT1基因的表达，从而影响肝癌SMMC7721细胞的迁移能力。然而，C/EBPβ调控MYCT1的具体机制尚不清楚，C/EBPβ是否是通过直接靶向结合MYCT1从而影响其生物学功能，仍需进一步研究证实。

综上所述，敲减MYCT1可显著增强肝癌细胞的迁移能力，而敲减C/EBPβ可显著上调MYCT1基因的表达，从而抑制肝癌细胞的迁移。但C/EBPβ调控MYCT1基因表达及其影响迁移功能的机制仍需进一步研究。本研究结果提示，C/EBPβ可能是MYCT1基因的一个潜在转录因子，为今后肝癌分子机制研究及靶向治疗提供了新的思路。