朱森林，梅 忠，邢承华

(金华职业技术学院 农业与生物工程学院，浙江 金华 321004)

镉(Cd)是一种毒性大的有害重金属。随着我国工业化、城镇化进程快速推进、污灌和含镉肥料的使用，土壤镉污染日趋严重。2014年发布的《全国土壤污染状况调查公报》显示，我国耕地镉污染物点位超标率已达7%。因此，土壤镉污染已成为当前亟需解决的一项重大环境问题。目前，常用化学、物理等传统方法来修复和治理镉污染土壤，但这些技术不容易管理，费用高，并且易带来二次污染[1]。基于重金属超积累植物的土壤污染修复技术因其经济、绿色、环保而备受关注。然而，由于超积累植物生长缓慢、生物量小，严重制约着其在镉污染土壤修复中的产业化应用。近年来，利用合理的养分管理措施阻控土壤中的镉进入农作物被认为是减控作物镉积累、达成保障农产品质量安全的重要策略之一[2]。阐明镉与矿质营养元素之间的互作关系，是上述策略的重要基础。

磷是植物必需的大量营养元素之一，对植物生长发育极其重要，施用磷肥是作物获得高产优质的关键保障。大量研究表明，磷对镉的影响十分复杂。在土壤溶液中，磷酸根离子能直接形成磷-镉沉淀物使镉钝化，同时镉离子也可以被难溶性磷酸盐直接吸附而降低有效性[3-4]。在植物体内，磷对镉的影响却表现出相反的效应，缺磷可以减少植物对镉的吸收，进而缓解镉对植物的毒害[5-6]。但迄今为止，缺磷如何减少植物根系对镉的吸收尚不清楚。除了镉的吸收积累和耐性受到磷的影响外，许多研究发现，铁(Fe)的吸收和利用也受到磷的影响。缺磷不仅可以提高植物体内铁的生物有效性[7-8]，还会抑制植物根系中铁吸收相关基因的表达，如铁转运蛋白基因IRT1[9]。IRT1是一种专一性相对较低的转运蛋白，除了转运二价铁离子外，还能转运镉离子。

磷养分管理是最为频繁的一项农艺措施，阐明植物体内磷与镉吸收的关系，可为合理进行磷养分管理、降低作物镉积累提供理论依据。基于此，本研究中以野生型拟南芥Col-0和铁吸收功能缺陷的突变体irt1为材料，研究缺磷处理和IRT1基因表达对拟南芥镉吸收的影响，为通过磷元素管理技术阻控植物镉吸收积累提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

以野生型拟南芥Col-0和IRT1功能缺失突变体irt1为材料。全营养液：NaH2PO4750 μmol·L-1，KNO31 500 μmol·L-1，MgSO4600 μmol·L-1，CaCl21 000 μmol·L-1，Fe-EDTA 50 μmol·L-1，H3BO310 μmol·L-1，ZnSO40.5 μmol·L-1，MnSO40.5 μmol·L-1，CuSO40.1 μmol·L-1，(NH4)6Mo7O240.1 μmol·L-1，用1 mol·L-1NaOH将营养液pH调至6.5。

将种子置于含有1/4全营养液的网膜上萌发，培养7 d后，将长势一致的幼苗移栽到全营养液中，置于人工气候室内培养，隔天换1次营养液。人工气候室内相对湿度65%，昼夜循环与温度分别为光照12 h/25 ℃、黑暗12 h/22 ℃，光照强度140 μmol·m-2·s-1。

1.2 方法

拟南芥在全营养液中培养5周后，将幼苗分成4组，进行如下处理：(1)缺磷无镉处理(-P-Cd)，(2)缺磷加镉处理(-P+Cd)，(3)正常供磷无镉处理(+P-Cd)，(4)正常供磷加镉处理(+P+Cd)。缺磷处理为全营养液中不含磷，镉处理为40 μmol·L-1CdCl2。

1.2.1IRT1基因表达分析

野生型拟南芥Col-0处理4、8 d后，取根系样品。采用RNA isoPlus试剂盒[宝生物工程(大连)有限公司]，根据说明书提取根RNA。提取的RNA样品用反转录试剂盒[Prime Script RT Reagent Kit，宝生物工程(大连)有限公司]合成第一条链cDNA。采用染料法实时荧光定量PCR试剂盒[SYBR® Premix Ex TaqTMII，宝生物工程(大连)有限公司]分析IRT1基因(AT4G19690)的表达，内参基因为UBQ10(AT4g05320)。每份RNA样品3次技术重复，每个处理4个生物学重复。定量PCR所用特异性引物如下：

IRT1-F：AAGCTTTGATCACGGTTGG；

IRT1-R：TTAGGTCCCATGAACTCCG。

UBQ10-F：ACCCTAACGGGAAAGACGA；

UBQ10-R：GGAGCCTGAGAACAAGATGAA。

反应条件：95 ℃预变性30 s；95 ℃ 5 s，65 ℃ 30 s，72℃ 30 s，共40个循环。所用仪器为MJ OptionTM2实时定量PCR仪(MJ ResearchTM)。采用2-ΔΔCt法计算IRT1基因的相对表达量。

1.2.2 叶绿素相对含量的测定

野生型拟南芥Col-0处理8 d后，采用SPAD-502P叶绿素计(柯尼卡美能达，日本)测定叶片叶绿素相对含量，每个处理12个生物学重复。

1.2.3 干质量测定

野生型拟南芥Col-0处理8 d后，分别收获根系和地上部，用吸水纸吸干根系水分，然后在75 ℃烘箱内烘干，测定地上部和根系的干质量。

1.2.4 过氧化氢(H2O2)含量测定

野生型拟南芥Col-0处理8 d后，参考Bai等[10]的方法测定H2O2含量：分别取0.2 g拟南芥根系和地上部样品，加1.5 mL 4 ℃预冷的丙酮研磨，转入离心管，补充丙酮至2.0 mL，10 000×g离心10 min，取0.8 mL上清液，加0.1 mL 5% TiSO4、0.2 mL 17 μmol·L-1NH3·H2O，10 000×g离心15 min，弃上清液，向沉淀中加5 mL 2 mol·L-1H2SO4溶解沉淀，测定415 nm波长的吸光度。每个处理4个生物学重复。

1.2.5 元素含量测定

植物收获后，分为根部和地上部。将根放入0.5 mmol·L-1氯化钙中清洗，再用去离子水冲洗3次后，用吸水纸吸干。根系与地上部分别称量后，置于80 ℃烘箱烘干。植物干样用优级纯浓硝酸(纯度68%)消解后，用超纯水稀释至40 mL过滤。滤液中的镉浓度用火焰原子吸收分光光度计(Thermo Scientific AAS，iCE3000)分析，每个处理4个生物学重复。

1.3 数据分析

数据采用SPSS进行统计，采用(ANOVA)两因素分析(two-way ANOVA)，并在0.05水平上进行Duncon检验。用KyPlot软件对数据进行作图。

2 结果与分析

2.1 镉胁迫下缺磷处理对叶绿素含量和干质量的影响

在无镉处理下，正常供磷和缺磷处理之间的叶绿素含量无显著差异，但40 μmol·L-1镉处理8 d后，与正常供磷处理相比，缺磷处理显著提高了Col-0拟南芥叶片的叶绿素相对含量(SPAD值)(图1)，表明缺磷缓解了镉诱导的叶片失绿黄化症状。

为进一步阐明不同供磷对拟南芥镉耐性的影响，分析了拟南芥根系和地上部组织的干质量，结果如图2所示。在无镉处理下，缺磷处理中Col-0植株根系和地上部的干质量显著低于正常供磷处理；但在40 μmol·L-1镉处理8 d后，与正常供磷处理相比，缺磷处理植株地上部和根系的干质量均显著提高，分别是正常供磷处理的2.1和1.9倍，表明缺磷可以缓解镉对拟南芥生长的抑制作用。

柱上无相同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下同。Data on the bars marked without the same lowercase letter indicated significant differences at P<0.05. The same as below.图1 镉胁迫下不同供磷处理的野生型拟南芥叶绿素相对含量Fig.1 SPAD value of wild-type Arabidopsis thaliana leaves of different phosphorus treatments under cadmium stress

图2 镉胁迫下不同供磷处理的野生型拟南芥干质量的影响Fig.2 Dry weight of wild-type Arabidopsis thaliana of different phosphorus treatments under cadmium stress

2.2 镉胁迫下缺磷对拟南芥H2O2含量的影响

由图3可见，无镉胁迫时，缺磷处理的植株根系和地上部的H2O2含量分别比正常供磷处理的植株增加了约45%和50%；但在40 μmol·L-1镉处理8 d后，与正常供磷处理的植株相比，缺磷植株的地上部和根系H2O2含量反而分别降低了40%和25%。表明缺磷可缓解镉胁迫导致的植物氧化损伤。

2.3 镉胁迫下缺磷对铁转运蛋白基因IRT1表达的影响

如图4所示，无镉和有镉条件下，缺磷处理的野生型拟南芥根系中IRT1表达量均显著低于正常供磷处理。

2.4 镉胁迫下缺磷对拟南芥镉含量的影响

为进一步阐明IRT1基因在缺磷减少植物镉吸收中的作用，比较了缺磷对Col-0和irt1突变体系，其镉含量超过了2 000 mg·kg-1。与正常供磷处理相比，缺磷处理使Col-0拟南芥地上部和根系中镉的含量减少了约40%和55%。说明缺磷可以减少拟南芥体内的镉含量，从而缓解镉胁迫。40 μmol·L-1镉处理8 d后，缺磷处理降低了irt1突变体根系和地上部的镉含量，但其降低幅度低于Col-0野生型植株。综上，缺磷可以减少镉胁迫下拟南芥体内的镉含量，IRT1基因可能参与这一过程。

数据以鲜质量计。Data was detected based on fresh weight.图3 镉胁迫下不同供磷处理的野生型拟南芥H2O2含量Fig.3 H2O2 content of wild-type Arabidopsis thaliana of different phosphorus treatments under cadmium stress

图4 镉胁迫下不同供磷处理的野生型拟南芥根系IRT1基因相对表达量Fig.4 Relative expression of IRT1 gene in root of wild-type Arabidopsis thaliana of different phosphorus treatments under cadmium stress

镉含量的影响。由图5可见，40 μmol·L-1镉处理8 d后，Col-0植株体内积累了大量的镉，尤其是根

数据以干质量计。Data was detected based on dry weight.图5 镉胁迫下不同供磷处理的野生型拟南芥和irt1突变体拟南芥镉含量Fig.5 Cd content of wild-type Arabidopsis thaliana and irt1 mutants of different phosphorus treatments under cadmium stress

3 讨论

植物体内的镉含量是决定其毒害程度的重要因素之一。本研究中，缺磷处理可显著降低镉胁迫下拟南芥体内的镉含量，缓解了Col-0野生型拟南芥因镉胁迫导致的H2O2积累、叶片失绿黄化。说明在镉污染环境中，缺磷处理可以减少植物对镉的吸收，从而缓解镉毒害。

镉胁迫下，缺磷处理也显著抑制了拟南芥铁转运蛋白基因IRT1的表达。由于磷酸根离子可与铁离子形成沉淀物，植物体内磷与铁元素存在拮抗作用，这意味着提高植物体内的磷水平可能会降低胞内铁的有效性，相反，降低植物体内的磷水平则可提高胞内铁的有效性。这在Abel[7]和Hirsch等[8]的研究中得到了证实。因此，缺磷处理造成IRT1基因表达受抑制可能与缺磷条件下植物体内铁有效性的提高有关。由于Cd2+与Fe2+水合离子半径高度相似[11]，双子叶植物中Fe2+吸收转运体IRT1已被证明是根系吸收Cd2+的关键转运蛋白之一[12]。在此基础上，一些研究发现，脱落酸、铵和增加外源供铁处理均可通过抑制IRT1表达来减少植物根系对镉的吸收[9，13-14]。鉴于缺磷显著抑制拟南芥根系中IRT1的表达，认为缺磷也是通过抑制根系中IRT1的表达来减少植物对镉的吸收。这一结论在IRT1功能缺失的突变体irt1中得到证实，因为缺磷处理对该突变体镉含量的降低效果明显低于Col-0野生型植株。

需要指出的是，在irt1突变体中，缺磷处理仍略微提高了拟南芥体内的镉含量，说明其他非IRT1途径也在缺磷减少植物镉吸收中发挥作用。除了IRT1蛋白，OPT3和Nramp家族铁转运蛋白等也能同时转运铁、镉[15-16]，缺磷也可能通过降低其他基因的表达量来减少植物的镉含量。这一推测有待于在今后的研究中利用相关突变体进行验证。