周冠进，孙玉婷，周李煜，陈韦凯，掌琳惠，胡文祺，刘福明，袁冬平

(1.南京中医药大学附属医院/江苏省中医院，江苏 南京 210029；2.南京中医药大学药学院，江苏 南京 210023)

动脉粥样硬化(AS)病理过程涉及大中动脉内膜脂质累积，并以血管壁慢性炎症为特征[1]。血管炎症发展过程中存在大量免疫炎性细胞[2]，包括巨噬细胞、T细胞和其他参与免疫应答的细胞[3]，巨噬细胞占据了这些细胞中的大部分[4]，其作为先天性免疫应答的主要细胞，在AS的发生发展过程中发挥关键作用[5]。巨噬细胞具有不同亚型，M1型巨噬细胞是一种炎性细胞，促进炎症发生发展，而M2型巨噬细胞则具有炎症抑制作用。研究发现，人类晚期动脉内膜病变中存在大量M1型巨噬细胞[6]，巨噬细胞向M1型极化是AS的风险因素之一。

冠心平是江苏省中医院院内制剂，在临床使用已有十余载，疗效确切。其主治功能为冠心病中的稳定型心绞痛、急性心肌梗死的辅助治疗，并且对AS治疗效果显著，但其作用机制尚未明确。本实验在体外RAW264.7巨噬细胞中探讨了冠心平含药血清对其极化的影响，并提出这可能是冠心平发挥抗AS作用的一个潜在机制，为临床上冠心平的应用提供了更多的理论依据。

1 材料

1.1 仪器

5417R型低温离心机(德国Eppendorf公司)；FACS Calibur流式细胞仪(美国BD公司)；Infinite M200PRO酶标仪(瑞士TECAN公司)；Revco ULT超低温冰箱(美国Thermo Fisher公司)；NanoDrop One微量紫外可见分光光度计(美国Thermo Fisher公司)；7500实时荧光定量PCR(qPCR)仪(美国Applied Biosystems公司)。

1.2 药物与试剂

冠心平片(江苏省中医院制备，批号：1812008；药片研磨成粉末后溶于蒸馏水并进行梯度稀释)；肿瘤坏死因子-α(TNF-α)酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒(MultiSciences；70-EK282/3-48)；转化生长因子-β1(TGF-β1)酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒(MultiSciences；70-EK981-48)；FITC Anti-Mouse CD206(Invitrogen；批号：UB2722231A)；PE Anti-Mouse F4/80(Invitrogen；批号：1950719)；APC Anti-Mouse CD86(Invitrogen，批号：4332810)；TRIzol试剂(Ambion)；Nuclease-free水(abm；G491)；DEPC水(biosharp；BL510A)；1× TE水(biosharp；BL531A)；5× All-In-One RT MasterMix(abm；G490)；EvaGreen 2× qPCR MasterMix(abm；MasterMix-PL)。

2 方法

2.1 分组、造模与给药

SD大鼠分为空白组、冠心平低剂量组(0.405 g/kg)、冠心平中剂量组(0.810 g/kg)、冠心平高剂量组(1.620 g/kg)，灌胃给药4 d，末次给药后1 h腹主动脉取血，室温静置2 h，3 000 r/min离心10 min提取血清，56 ℃热灭活30 min，细胞给药前0.22 μm滤器过滤。

巨噬细胞极化造模：取RAW264.7细胞悬液，调整密度为3×105mL-1，接种于6孔板，贴壁培养12 h后药物处理24 h，除空白组以外的其余各组细胞在药物处理结束后加入100 ng/mL LPS刺激12 h。

2.2 ELISA法测定培养上清中细胞因子含量

ELISA法测定细胞上清TNF-α、TGF-β1水平，具体参考试剂盒说明书进行，通过酶标仪进行测定。

2.3 流式细胞术检测巨噬细胞极化特征性分子

细胞密度调整为3×105mL-1，接种于6孔板，培养12 h。药物作用结束后，收集细胞，4 ℃离心(2 000 r/min；5 min)，于100 μL染色缓冲液(1% BSA-PBS)中重悬，加入相应流式抗体(F4/80：1.25 μL；CD86：0.3 μL；CD206：5 μL)进行表面染色，4 ℃避光孵育30 min，1 mL染色缓冲液洗涤1次，离心，500 μL染色缓冲液重悬细胞，上机检测。

2.4 qPCR法检测巨噬细胞极化特征性分子mRNA表达水平

使用TRIzol试剂从细胞中提取总RNA。逆转录成模板DNA前，RNA定量为100 ng/μL。qPCR操作及反应条件按试剂盒说明书进行，其中引物委托上海生工生物工程有限公司合成，引物信息见表1。数据按2-ΔΔCt法(内参GAPDH)分析。

表1 引物序列

2.5 统计学分析

3 结果

3.1 冠心平对M1/M2型巨噬细胞相关细胞因子分泌的影响

ELISA法检测巨噬细胞上清细胞因子分泌情况。结果显示，与模型组相比，冠心平高剂量组细胞TNF-α分泌水平显著下降(P<0.01)；冠心平各剂量组细胞TGF-β1分泌水平均显著下降(P<0.01)。结果见图1。

3.2 冠心平对巨噬细胞M1/M2型表面分子表达水平的影响

流式检测结果显示，与空白对照组比较，模型组细胞CD86表达显著升高(P<0.01)，CD206表达水平显著降低(P<0.01)。与模型组比较，冠心平低、高剂量组CD86表达显著性下降(P<0.05～0.01)，而CD206表达显著增加(P<0.05～0.01)。结果见图2。

3.3 冠心平对巨噬细胞M1/M2型特征分子mRNA表达水平的影响

qPCR检测各组巨噬细胞CD86、CD206 mRNA水平。结果显示，与模型组比较，CD86mRNA水平均未出现显著性变化，而CD206 mRNA水平在给药各剂量组中均出现显著上升(P<0.05～0.01)。结果见图3。

4 讨论

由AS引起的各类心血管疾病是全世界人口死亡的重要原因。不平衡的脂质代谢和慢性炎症反应是AS的潜在发病机制[7]。巨噬细胞对AS的发生发展产生了重要作用，体内缺乏巨噬细胞的小鼠，其AS进程减缓[8-9]，而巨噬细胞亚群M1/M2比例失衡能够反映AS疾病进程并能够影响其发生发展。经典激活的M1型巨噬细胞具有促炎效应，而选择性激活的M2型巨噬细胞则表现出炎性抑制作用[10]。

冠心平治疗AS临床效果明确，但其是否可以通过影响巨噬细胞极化尚未见报道。本研究采用小鼠RAW264.7巨噬细胞系作为研究对象，选用LPS进行处理，在体外模拟巨噬细胞在AS环境中受到的炎性刺激，造成巨噬细胞M1型极化模型，100 ng/mL LPS处理的巨噬细胞表现出M1型极化特征，而冠心平含药血清的干预则抑制了M1型极化，促进向M2极化。

TNF-α主要由M1型巨噬细胞分泌，增强和维持炎性应答[11-12]，TGF-β1则主要由M2型巨噬细胞分泌。研究结果表明，高剂量的冠心平含药血清抑制巨噬细胞TNF-α分泌。然而，冠心平含药血清降低了巨噬细胞TGF-β1的分泌，这与我们预期的结果不一致。为此，我们进一步观察了巨噬细胞的表型变化。

CD86和CD206分别是M1和M2巨噬细胞的特征性表面分子[13]，CD86表达的增加意味着M1型巨噬细胞的增加，而CD206的增加则代表着更多M2巨噬细胞的产生。流式结果表明，冠心平含药血清处理抑制了巨噬细胞M1型极化而有利于M2型极化。对于CD206 mRNA的检测结果与流式结果一致，表明了M2型巨噬细胞的增加。这说明冠心平含药血清巨噬细胞极化的作用在M1/M2表型中较为明显，而对其功能的调控可能稍弱。我们推测冠心平含药血清可能首先改变了巨噬细胞表型，但对于其功能的发挥在本实验条件下尚未显示出效果。另外，TGF-β1功能具有多样性，冠心平在体外导致了巨噬细胞TGF-β1分泌减少，但这可能在体内复杂环境中对某些下游炎性因素具有调控作用,这将在我们今后的实验中加以证实。

综上，冠心平含药血清一定程度上抑制了小鼠RAW264.7巨噬细胞系向M1型极化，促进其向M2型极化，并且这可能是其治疗AS的一个潜在机制，关于其产生这些效应的内在机制还值得进一步探究。