李冰怡 李谦谦 宫世萌 李娇娇 郑雪 段红英

摘 要： 核苷二磷酸激酶（NDPK）是一种高度保守的多功能蛋白，具有催化底物磷酸化的作用，能够参与植物的生长发育、非生物胁迫、感病应激、光合作用和能量代谢等过程。为了解地黄核苷二磷酸激酶基因（RgNDPK Ⅰ）的结构、功能和性质，该研究利用地黄转录组学数据，通过电子克隆的方法获得了RgNDPK Ⅰ基因的全长cDNA序列，长度为765 bp。生物信息学分析结果表明，RgNDPK Ⅰ基因的开放阅读框长度为447 bp，编码148个氨基酸，具有典型的核苷二磷酸激酶活性结构域和其他磷酸化活性位点。RgNDPK Ⅰ基因编码的蛋白质定位于细胞质，是无跨膜区域的亲水性蛋白，该蛋白质与芝麻、紫花风铃的核苷二磷酸激酶相似性较高，分别为97%和96%。在多种生物中已经克隆得到了核苷二磷酸激酶基因，且不同植物核苷二磷酸激酶氨基酸序列中存在多个相似的保守结构域，推测RgNDPK Ⅰ基因所编码的蛋白质为核苷二磷酸激酶超家族成员。该研究结果为进一步探明RgNDPK Ⅰ的性质、结构、功能及表达机制提供了重要的理论依据。

关键词： 地黄， 核苷二磷酸激酶（NDPK）， 电子克隆， 生物信息学

中图分类号： Q943  文献标识码： A

文章编号： 1000-3142（2020）04-0492-09

Abstract： Nucleoside diphosphate kinase （NDPK） is a highly conserved multifunctional protein， can catalyze substrate phosphorylation and participate in many metabolic processes， such as plant growth and development， abiotic stress， susceptible stress， photosynthesis and energy metabolism. In order to understand the structure， function and character of NDPK gene in Rehmannia glutinosa （RgNDPK Ⅰ）， full length cDNA of RgNDPK Ⅰ was obtained by silico cloning from the transcriptome data of Rehmannia glutinosa. The length of RgNDPK Ⅰ was 765 bp. According to bioinformatics analysis， with an open reading frame of 447 bp， RgNDPK Ⅰ encodes 148 amino acids， and has typical nucleoside diphosphate kinase domain and other phosphorylation active sites. The protein encoded by RgNDPK Ⅰ was located in the cytoplasm， and it was hydrophilic protein without transmembrane region. The protein was similar to nucleoside diphosphate kinase of Sesamum indicum and Handroanthus impetiginosus， 97% and 96% respectively. NDPK gene has been cloned in many organisms， and there are many similar conservative domains in the amino acid sequences of different plants， so it is presumed that RgNDPK Ⅰ is a member of the nucleoside diphosphate kinase superfamily. This study provides an important theoretical basis for further exploring the character， structure， function and expression mechanism of RgNDPK Ⅰ.

Key words： Rehmannia glutinosa， nucleoside diphosphate kinase（NDPK）， silico cloning， bioinformatics

核苷二磷酸激酶（nucleoside diphosphate kinase，NDPK）廣泛存在于生物界，1953年Burg等人第一次发现了NDPK蛋白（Dumas et al.， 1992），近年来人们对NDPK的研究兴趣愈发浓厚（Bominaar et al.， 1993）。研究发现NDPK是一种进化上非常保守的酶（Hu et al.， 2015），能够催化底物磷酸化、维持生物体内核苷酸的代谢平衡 （刘孟等，2016），还可能参与细胞增殖与发育的过程（Hu et al.， 2015），也有研究表明核苷二磷酸激酶A表达量和多种肿瘤转移呈负相关（熊盛等，2004）。植物核苷二磷酸激酶的研究开始较晚，自从1971年于豌豆中分离得到第一个NDPK后（Edlund，1971），已从拟南芥、芒果、水稻、芝麻等植物中分离出NDPK。目前研究的植物核苷二磷酸激酶主要有NDPKⅠ、NDPKⅡ和NDPKⅢ三种，其中植物NDPKⅠ的含量最高（Manigbas et al.， 2011），占NDPKs总活性的70%以上（王文斌等，2011），且活性最强（Hetmann & Kowalczyk，2009），可对多种底物起催化作用，但对底物有一定的偏好性，优先选择利用ATP（Zrenner et al.， 2006）。一些研究发现核苷二磷酸激酶是一种高度保守的多功能蛋白，能够参与植物的多种代谢调节过程（孙小洁和王增兰，2012），包括植物生长发育、非生物胁迫、感病应激、光合作用和能量代谢等（朱馨妮等，2017）。

地黄（Rehmannia glutinosa）为玄参科（Scrophulariaceae）地黄属（Rehmannia）多年生草本植物，其新鲜或干燥根块茎可入药（药典委员会，2010）。全国各地都有种植地黄，尤其以怀地黄药效最佳，具有增强免疫、抗病毒、降血糖、抗氧化、滋阴清热、补血止血等多种效用（Duan et al.， 2018）。本研究从地黄中克隆了核苷二磷酸激酶基因的全长cDNA序列，并对其进行了相关生物信息学分析（郑雪等，2018），以期进一步探明地黄核苷二磷酸激酶的性质、结构及功能，为研究植物核苷二磷酸激酶的功能及其机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

本研究以地黄85-5长势良好的块根为实验材料，其栽培于河南师范大学试验田。根据电子克隆法得到的地黃核苷二磷酸激酶基因全长cDNA序列，设计扩增目的基因的PCR引物，F：5′-ATGGAGCAGACTTTCATTATG-3′， R：5′-TCACTGATAGAT

CCAGGAGTGAA-3′，PCR扩增引物由上海生物工程公司合成。大肠杆菌Escherichia coli DH5α菌种、T4克隆载体购于宝生物工程（大连）有限公司。

1.2 试剂

在本研究中，主要用到以下试剂：反转录试剂盒（南京诺唯赞生物科技有限公司），琼脂糖、溴化乙锭（四川维克奇生物科技有限公司），引物（Invitrogen公司），胶回收试剂盒、DNA Marker（DL2 000）（宝生物生物技术公司），上样缓冲液为6×Loading Buffer、2×Tap Master Mix（北京康为世纪生物科技有限公司）等，其他常规试剂均为国产分析纯。

1.3 方法

1.3.1 RNA的提取及反转录 以地黄85-5的成熟块根为实验材料。首先，通过Trizol法提取总RNA，用DNase/RNase-free处理，酚-氯仿抽提去除DNase，乙醇沉淀回收RNA（孙鹏等，2008）。然后，通过微量分光光度计检测RNA的260 nm/280 nm及其RNA的浓度，并采用琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。

本实验利用HiScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit反转录试剂盒进行地黄cDNA的制备，按照说明书的操作进行实验以合成cDNA第一链。

1.3.2 目的基因的克隆 电子克隆是在已建立的核酸序列与蛋白质序列数据库的基础上，利用计算机技术与生物信息学工具进行快速比对、拼接及分析从而获得基因的部分乃至全长cDNA序列（葛春艳等，2018）。本研究以地黄85-5六个发育时期的组合块根所转录出的RNA总和为材料进行转录组测序，采用HiSeq 2500 Illumina测序平台进行测序，通过blast与其他公共数据库进行同源性比对，获得基因功能的注释（王向楠，2017）。利用电子克隆的方法得到目的基因cDNA全长，然后在CDS区设计引物，以地黄的cDNA为模板，采用PCR技术克隆得到核苷二磷酸激酶的全长cDNA序列。

PCR扩增反应条件如下：首先，95 ℃预变性3 min;然后，95 ℃变性30 s，47 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35个循环;最后，72 ℃总延伸10 min。PCR产物用琼脂糖凝胶电泳进行检测，所得产物进行胶回收并连接到pMDl9-T载体上，然后转化E.coli DH5α感受态细胞，涂布于添加氨苄青霉素（100 mg·L-1）、IPTG、X-gal的LB平板上，37 ℃培养12～16 h后进行蓝白斑筛选及菌落PCR检测，阳性克隆送至金唯智生物技术有限公司测序。

1.3.3 生物信息学分析 本研究通过blastp对RgNDPK Ⅰ基因编码的氨基酸序列进行相似性搜索，并利用MEGA7.0和blastn构建其系统进化树。使用DNAMAN分析RgNDPK Ⅰ编码蛋白的相对分子质量、等电点及其同源蛋白的多序列比对。通过EXPASYPROTSCALE （http：//web.expasy.org/protparam/）、TMHMM （http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）分别分析RgNDPK Ⅰ编码蛋白的疏水性及其跨膜区，采用EXPASYSignalP4.0Serve （http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）分析RgNDPK Ⅰ编码蛋白的信号肽，并利用CBS数据库中的TargetP预测RgNDPK Ⅰ编码蛋白的亚细胞定位。另外，通过NCBI的CDD分析RgNDPK Ⅰ编码蛋白的结构域，利用SOPMA （http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）预测了RgNDPK Ⅰ编码蛋白的二级结构，同时采用SWISS-MODEL （http：//swissmodel.expasy.org/workspace/index.php？func=modelling_simple1&userid=USERID & token=TOKEN）同源建模方法对RgNDPK Ⅰ编码蛋白进行在线3D结构预测。

2 结果与分析

2.1 地黄RgNDPK Ⅰ基因的克隆

本研究利用地黄的转录组学数据，通过电子克隆法得到地黄核苷二磷酸激酶基因的全长cDNA序列，然后在CDS区设计引物，以地黄的cDNA第一链为模板进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测结果表明扩增片段长750 bp左右（图 1），与预期结果相符。

测序结果表明目的基因的全长cDNA序列为765 bp，ORF Finder分析得知其开放阅读框（ORF）位于第125～571个核苷酸，长度为447 bp，编码148个氨基酸 （图 2）。INTERPROSCAN和CDD的预测结果显示RgNDPK Ⅰ基因编码蛋白的保守结构域为核苷二磷酸激酶结构域，且与NDPKⅠ的保守结构域高度相似，表明该目的基因编码蛋白是核苷二磷酸激酶超家族成员，且属于NDPKⅠ类，推测其功能与核苷三磷酸盐（NTPs）的合成有关。因此，本研究将克隆到的地黄核苷二磷酸激酶基因命名为RgNDPK Ⅰ ，并把RgNDPK Ⅰ基因数据提交至GenBank数据库，其GenBank数据库登陆号为MK248733。

2.2 地黄RgNDPK Ⅰ编码蛋白的理化性质

地黄RgNDPK Ⅰ基因编码蛋白的相对分子质量为16 395.82，等电点为6.30。在RgNDPK Ⅰ的氨基酸种类组成中，甘氨酸（Gly）和异亮氨酸（Ile）的含量最多。

蛋白疏水性预测结果表明地黄RgNDPK Ⅰ属于亲水蛋白（图 3），且不存在跨膜区。另外，蛋白亚细胞结构定位结果表明，地黄RgNDPK Ⅰ定位于细胞质，且可信度为2（图4）。

2.3 地黄RgNDPK Ⅰ编码蛋白的结构预测

二级结构预测结果表明， 地黄RgNDPK Ⅰ主要由α螺旋、无规卷曲、延伸链和β折叠构成，其中α螺旋占49.32%、无规卷曲占23.66%、延伸链占18.24%、β折叠占8.78%（图5：A）。由此可知，该蛋白中α螺旋比例最高。RgNDPK Ⅰ的三级结构（图 5：B）与二级结构预测结果一致，推测地黄RgNDPK Ⅰ可能为α螺旋型蛋白。

2.4 地黄RgNDPK Ⅰ编码蛋白的同源序列分析

利用blastp程序对地黄 RgNDPK Ⅰ基因编码的氨基酸序列进行同源性分析，结果表明RgNDPK Ⅰ与芝麻、紫花风铃的核苷二磷酸激酶的相似性最高，分别为97%和96%（表 1）。RgNDPK Ⅰ与紫花风铃（PIN18357.1）、芝麻（XP_011093235.1）等物种核苷二磷酸激酶的多序列比对分析结果如图 6所示，序列相似性达96.25%，表明核苷二磷酸激酶蛋白的氨基酸序列在不同物种之间较为保守。

利用blastn和MEGA7.0将RgNDPK Ⅰ氨基酸序列与同源性较高的其他物种的核苷二磷酸激酶序列进行系统进化分析，选择参数Test of Phylogeny为Bootstrap method，设置No. of Bootstrap Replications为100，其他参数均为默认值，分析发现地黄与芝麻和紫花风铃的核苷二磷酸激酶进化距离近，表明其亲缘关系较近;而与向日葵、黄胡萝卜核苷二磷酸激酶的亲缘关系较远（图7）。

3 讨论

核苷二磷酸激酶属于核苷二磷酸激酶超家族，具有催化底物磷酸化的作用（刘孟等，2016），在植物的种子萌发、非生物胁迫、感病应激、光合作用、防御保护相关基因的诱导表达、能量代谢和信号传递等过程具有调控作用（Yang et al.， 2003;王文斌等，2011;孙小洁和王增兰，2012;朱馨妮等， 2017）。目前， 植物中研究的核苷二磷酸激酶主要有NDPKⅠ、NDPKⅡ、NDPKⅢ三種。一些研究发现植物NDPKⅠ、NDPKⅡ、NDPKⅢ具有不同的亚细胞定位，其中NDPKⅠ通常定位于细胞质、细胞核，NDPKⅢ定位于叶绿体、线粒体，而NDPKⅡ可能定位于叶绿体（王文斌等，2011）。本研究利用地黄的转录组学数据，通过电子克隆法（高兴春等，2005）首次从地黄中克隆得到的核苷二磷酸激酶基因RgNDPK Ⅰ的cDNA序列，开放阅读框长度为447 bp，共编码148个氨基酸，RgNDPK Ⅰ基因编码蛋白含有保守的核苷二磷酸激酶结构域和其他磷酸化活性位点，其结构域与NDPKⅠ的保守结构域高度相似，而且亚细胞定位于细胞质，表明RgNDPK Ⅰ是核苷二磷酸激酶超家族成员，且属于NDPKⅠ类。因此，推测RgNDPK Ⅰ基因可能在植物生长发育和感病应激等信息传递、非生物胁迫、淀粉和纤维素的合成等方面发挥作用（朱馨妮等，2017）。

进一步分析发现地黄RgNDPK Ⅰ与芝麻、紫花风铃的核苷二磷酸激酶相似性较高，分别为97%和96%，而且不同植物的核苷二磷酸激酶存在多个相似的保守结构域，这与前人的研究结果相似（罗睿雄等，2016），进一步证明地黄RgNDPK Ⅰ为核苷二磷酸激酶超家族成员。目前，植物核苷二磷酸激酶已从多种植物中被分离出来，其研究也取得了较大的进展。刘孟（2016）研究发现核苷二磷酸激酶具有催化磷酸基团转移的作用，罗睿雄等（2016）研究发现芒果NDPK具有重要的化学反应催化功能和调控植物响应逆境胁迫的作用，谭龙（2011）研究表明NDPKⅢ通过调节植物的氧化胁迫参与了响应多环芳烃菲的应答，梁潘霞等（2012）也对甘蔗核苷二磷酸激酶基因进行了克隆和功能验证。另外，NDPKⅠ在不同植物中功能表现存在差异，在一些植物中发挥特殊功能作用，如马铃薯NDPKⅠ参与了淀粉和纤维素的合成，玉米中存在G4结构的NDPKI可以与DNA结合（朱馨妮等，2017）。虽然本研究对地黄RgNDPK Ⅰ基因进行了克隆及生物信息学分析，但是关于地黄RgNDPK Ⅰ基因的具体功能及其作用机制仍需要进一步深入研究。

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（责任编辑 周翠鸣）