孟圆圆，迟鹏宇，马丽辉，陈敏，孙冬霞，庞岚，李燕

子宫内膜癌（endometrial carcinoma，EC）是女性生殖系统常见恶性肿瘤之一，其发病率仅次于宫颈癌［1］。EC早期常无明显临床症状，确诊时常处于晚期且病情进展较快，患者预后不佳［2］。目前，手术、放疗、药物或三者联合是临床治疗EC的常用手段［3］，经治疗后患者5年生存率为70%～80%［4］，但EC的具体发病机制尚不清楚，因此临床迫切需要寻找有助于早期诊断及治疗EC的靶分子。微小RNA（miRNA）是长度为l9～25个核苷酸的内源性非编码小分子RNA，可直接调控靶基因表达，参与人类多种癌症的发生发展过程［5］。研究表明，miRNA-944在EC组织中呈高表达，并可促进肿瘤形成［6］。近年越来越多研究开始关注miRNA-373在恶性肿瘤（如肝癌［7］、肺癌［8］）发生发展过程中的作用，但其在EC中的作用鲜有报道。本研究旨在探讨EC组织miRNA-373表达情况及其对EC细胞增殖、迁移的影响，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2012年6月—2013年6月在邯郸市妇幼保健院行手术治疗的64例EC患者的EC组织作为试验组，患者年龄32～63岁，平均年龄（52.1±6.4）岁。纳入标准：（1）病历资料完整；（2）病理检查结果为EC；（3）术前未行其他治疗。排除标准：（1）合并其他类型恶性肿瘤者；（2）合并全身感染性疾病者；（3）合并心、肺、肝、肾等重要脏器及血液、内分泌、免疫等系统疾病者。另选取同期在邯郸市妇幼保健院行子宫切除术的30例良性子宫肌瘤患者的正常组织作为对照组。所有组织标本经液氮冷冻后于-80 ℃冰箱中储存备用。本研究经邯郸市妇幼保健院医学伦理委员会审核批准，所有患者签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 miRNA-373、大型肿瘤抑制基因2（LATS2）检测方法 采用美国Invitrogen公司生产的Trizol试剂提取两组组织标本中总RNA，采用RevertAid RT Reverse Transcription试剂盒（Thermo Fisher Scientific，Inc）进行cDNA合成，并应用SYBR Green RT-qPCR 试 剂 盒（Kapa Biosystems，Inc.，MA，USA）检测mRNA表达水平。实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）扩增体系为10 ml，反应条件：95 ℃预变性30 s，95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，共 40个循环。U6、GAPDH分别作为miRNA-373和LATS2的内参。每个组织标本重复检测3次，应用2-ΔΔct法计算miRNA-373、LATS2相对表达量。miRNA-373引物序列： 正 向：5'-GAAGTGCTTCGATTTTGGGGTGT-3'，反 向：5'-TGCCGCCTGAACTTCACTCC-3'；LATS2引物序列：正向：5'-ATGAGCTCCACTCTGCTC AATGTCACGG-3'， 反 向：5'-GCAAGCTTCTCT ACCAAGAATGAAAGAGCAT-3'；U6引 物 序 列：正 向：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'， 反 向：5'-ACGCTTCACGAATTTGCGT-3'；GAPDH引物序列：正向：5'-GCACCGTCAAG GCTGAGAAC-3'，反向：5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3'。

1.2.2 随访 EC患者术后均进行电话及门诊随访，并统计其术后5年生存情况，终点事件为死亡。

1.2.3 细胞实验方法

1.2.3.1 细胞系培养 人子宫内膜腺癌细胞系AN3CA、HEC-1A、HEC-1B和永生化人子宫内膜基质细胞T-HESC均购自中国科学院上海细胞库，将各细胞置于含10%胎牛血清（FBS）的RPMI1640（HyClone，Logan，UT，USA）中，在37 ℃含5%二氧化碳（CO2）恒温培养箱中培育。与T-HESC细胞相比，AN3CA、HEC-1A、HEC-1B细胞系中miRNA-373表达上调，且HEC-1B细胞系中miRNA-373表达上调最明显，因此本研究选择HEC-1B细胞系进行后续实验。

1.2.3.2 细胞转染 miRNA-373模拟物（miRNA-373 mimic）、miRNA-373抑制剂（miRNA-373 inhibitor）及其相对阴性对照物（分别为mimic-NC，inhibitor-NC）均购自GenePharma（中国上海）。采用Lipofectamine 2000（Invitrogen，Carlsbad，USA） 试 剂盒进行转染，分别采用miRNA-373 mimic、miRNA-373 inhibitor、mimic-NC，inhibitor-NC转染HEC-1B细胞，具体操作如下：将3×105个细胞接种至6孔细胞培养板，在融合度达到50%时加入配置好的转染物（10 μl miRNA-373 mimic或miRNA-373 inhibitor或mimic-NC或inhibitor-NC+125 μl无血清无抗生素培养基+5 μl Lipofectamine 2000试剂）并置于培养箱中培养，本研究细胞转染率约为70%。

1.2.3.3 细胞增殖 采用噻唑蓝（MTT）法检测细胞增殖情况，具体操作如下：将分别转染miRNA-373 mimic、miRNA-373 inhibitor、mimic-NC，inhibitor-NC的HEC-1B细胞4×103个置于96孔板中孵育，分别于转染0、24、48、72、96 h后将细胞在含1 mg/ml 37 ℃MTT无血清培养基中培养4 h，去上清液后溶解在二甲基亚砜中（100 ml），采用Molecular Devices酶标仪在波长570 nm处读取吸光度值，以转染时间为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制细胞增殖曲线。

1.2.3.4 细胞迁移 采用穿梭小室（Transwell）（8 μm孔径膜）检测细胞迁移，具体方法如下：分别将转染miRNA-373 mimi、miRNA-373 inhibitor、mimic-NC、inhibitor-NC的HEC-1B细胞在无血清培养基温育24 h，将3×104个HEC-1B细胞放入上室中，同时将含有10% FBS的递质置于下室中，24 h后在37 ℃环境下完全除去非迁移细胞；采用4%多聚甲醛固定迁移细胞，0.5%结晶紫染色液染色，显微镜下计数迁移细胞数量。

1.2.4 基因检测方法 采用双荧光素酶报告基因系统验证miRNA-373与LATS2间的靶标关系，主要技术流程如下：采用生物信息学方法分析并预测启动子区可能的转录因子结合位点；将野生型或突变型LATS2〔生工生物工程（上海）股份有限公司〕的3'-UTR插入pGL3-basic质粒载体（Promega，Madison，USA）中，扩增、克隆并提纯质粒备用；将野生型或突变型LATS2和miRNA-373 miminc的3'-UTR转染至HEC-1B细胞中，24 h后使用DualGlo荧光素酶测定试剂盒（Promega）检测相对荧光强度以分析荧光素酶活性，并与空载对照比较。

1.3 统计学方法 采用SPSS 19.0统计学软件进行数据处理，计量资料以（±s）表示，两组间比较采用两独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析；计数资料分析采用χ2检验；采用Graphpad Prism 6软件绘制Kaplan-Meier生存曲线以分析不同miRNA-373表达情况EC患者术后5年预后，采用Log-rank检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 临床研究结果

2.1.1 miRNA-373表达情况 对照组miRNA-373相对表达量为（0.48±0.17），试验组为（1.32±0.29）；试验组miRNA-373相对表达量高于对照组，差异有统计学意义（t=2.634，P=0.008）。

2.1.2 术后5年预后 根据miRNA-373平均值将试验组患者分为低表达组（n=26）和高表达组（n=38），Kaplan-Meier生存曲线显示，高表达组患者术后5年累积生存率为52.6%，低于低表达组的84.6%，差异有统计学意义（χ2=5.682，P=0.020，见图1）。

2.2 细胞实验结果

2.2.1 LATS2表达 转染miRNA-373 mimic的HEC-1B细胞LATS2相对表达量为（0.42±0.06），低于转 染 mimic-NC的 HEC-1B细 胞 的（0.91±0.18），差异有统计学意义（t=3.143，P=0.032）；转染miRNA-373 inhibitor的HEC-1B细胞LATS2相对表达量为（2.03±0.02），高于转染inhibitor-NC的HEC-1B细胞的（1.11±0.08），差异有统计学意义（t=3.626，P=0.014）。

2.2.2 细胞增殖 转染96 h后，转染miRNA-373 mimic的HEC-1B细胞吸光度值高于转染mimic-NC的HEC-1B细胞，差异有统计学意义（t=3.499，P=0.023，见图2A）；转染96 h后，转染miRNA-373 inhibitor的HEC-1B细胞吸光度值低于转染inhibitor-NC的HEC-1B细胞，差异有统计学意义（t=3.256，P=0.015，见图2B）。

图1 不同miRNA-373表达情况EC患者术后5年生存情况的Kaplan-Meier生存曲线Figure 1 Kaplan-Meier survival curve for postoperative five-year survival status in EC patients with different expression of miRNA-373

2.2.3 细胞迁移 转染miRNA-373 mimic的HEC-1B细胞中迁移细胞数量为（178±12）个，多于转染mimic-NC的HEC-1B细胞的（77±25）个，差异有统计学意义（t=4.585，P=0.006）；转染miRNA-373 inhibitor的HEC-1B细胞中迁移细胞数量为（25±6）个，少于转染inhibitor-NC的HEC-1B细胞的（70±10）个，差异有统计学意义（t=4.061，P=0.002）。

2.3 基因检测结果 生物信息学分析结果显示，LATS2含有miRNA-373的潜在结合位点（见图3）。双荧光素酶报告基因系统检测结果显示，野生型LATS2中miRNA-373相对荧光强度为（0.24±0.05），低于空载对照的（0.96±0.07），差异有统计学意义（t=5.287，P＜0.01）；突变型LATS2中miRNA-373相对荧光强度为（0.98±0.04），与空载对照的（0.96±0.07）比较，差异无统计学意义（t=0.281，P=0.928）。

图2 miRNA-373 mimic、miRNA-373 inhibitor转染HEC-1B细胞后不同时间点吸光度值变化Figure 2 Changes of optical density in HEC-1B cells after transfection of miRNA-373 mimic or miRNA-373 inhibitor at different time points

图3 LATS2结合位点和miRNA-373基因启动子的示意图Figure 3 Schematic diagram for LATS2 binding site and miRNA-373 gene promoter

3 讨论

EC患者常无特异性临床表现，但患者病情进展快、发病过程复杂、预后差。随着近年科学技术发展，EC的诊断和治疗虽有了很大程度改善，但EC晚期患者生存率仍较低，预后仍不乐观［9］。研究表明，miRNA可通过靶向癌基因或抑制癌基因而延缓癌症进展，且多种miRNA在癌症患者中存在异常表达［6］。miRNA-373是miRNA的一员，参与了多种癌症的发生发展过程，如肾细胞癌［10］、胃癌［8］等。谭飞非等［11］研究结果显示，miRNA-373在EC组织中呈高表达，但其潜在作用机制尚不清楚。本研究结果显示，试验组miRNA-373相对表达量高于对照组，且高表达组患者术后5年累积生存率低于低表达组，提示miRNA-373有可能作为早期诊断EC并预测EC患者不良预后的生物学靶分子。

miRNA-373与多种肿瘤的发生发展密切相关。2006年，VOORHOEVE等［12］首次发现并证实miRNA-373是致癌基因，并可促进恶性肿瘤形成。近年研究表明，在食管鳞状细胞癌中miRNA-373会通过抑制TIMP3表达而增强细胞侵袭和迁移能力［8，12］；在肝癌中，miRNA-373 inhibitor可通过下调miRNA-373的表达而抑制细胞增殖及诱导细胞凋亡［7］。本研究结果显示，转染96 h后，转染miRNA-373 mimic的HEC-1B细胞吸光度值高于转染mimic-NC的HEC-1B细胞；转染miRNA-373 inhibitor的HEC-1B细胞吸光度值低于转染inhibitor-NC的HEC-1B细胞；转染miRNA-373 mimic的HEC-1B细胞中迁移细胞数量于转染mimic-NC的HEC-1B细胞；转染miRNA-373 inhibitor的HEC-1B细胞中迁移细胞少于转染inhibitor-NC的HEC-1B细胞，提示miRNA-373表达上调可促进EC细胞增殖、迁移，而下调其表达则可抑制EC细胞增殖、迁移，与miRNA-373 在胃癌［13］、纤维肉瘤［14］、膀胱癌［15］中的作用相似。也有研究表明，miRNA-373在结肠癌［15］、胶质瘤［16］、非小细胞肺癌［17］中具有抑癌作用，分析其原因可能为：恶性肿瘤形成是一个非常复杂的过程，并受到多种因素影响，miRNA-373在不同肿瘤中可能通过不同途径发挥促癌或抑癌作用。

LATS2是Hippo途径的重要组成部分，在细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭过程中具有至关重要的调节作用［18］。研究表明，LATS2作为一种肿瘤抑制因子，可下调B淋巴细胞-2基因（Bcl-2）和B淋巴细胞-xl基因（Bcl-xl）并促进细胞凋亡［19］；此外，LATS2高表达还能通过抑制素鼠双微体蛋白2（Mdm2）的E3泛素连接酶活性而导致G1/S期细胞周期停滞［20］。此外，miRNAs主要通过调控靶基因而参与细胞增殖、分化、凋亡等过程，而LATS2作为抑癌基因已被多种miRNAs作为靶向位点，如LATS2可作为miRNA-135b靶向位点并促进乳腺癌细胞增殖［21］。GAO等［22］研究表明，miRNA-31可通过Hippo途径而抑制LATS2表达，进而激活上皮-间质转化，促进食管鳞状细胞癌的发生发展。本研究结果显示，LATS2含有miRNA-373的潜在结合位点，提示EC组织细胞中miRNA-373可直接靶向调节LATS2的表达。值得注意的是，已有研究证实，miRNA-373转录后可调节LATS2的表达并刺激人食管癌细胞增殖［23］。本研究结果显示，野生型LATS2中miRNA-373相对荧光强度低于空载对照，突变型LATS2中miRNA-373相对荧光强度与空载对照比较无统计学差异；转染miRNA-373 mimic的HEC-1B细胞LATS2相对表达量低于转染mimic-NC的HEC-1B细胞，而转染miRNA-373 inhibitor的HEC-1B细胞LATS2相对表达量高于转染inhibitor-NC的HEC-1B细胞，提示miRNA可能通过靶向调节LATS2的表达而促进EC细胞增殖、迁移。

综上所述，miRNA-373在EC组织中呈高表达，其可能通过靶向调节LATS2的表达而促进EC细胞增殖、迁移，进而影响EC患者预后，这为EC发生发展机制提供了一定的理论基础；但本研究未探讨miRNA-373调节LATS2的具体机制，仍需后续研究进一步探索。

作者贡献：孟园园、李燕进行试验设计与实施、资料收集整理、撰写论文并对文章负责；迟鹏宇、马丽辉、陈敏进行试验实施、评估、资料收集；庞岚进行数据整理并指导撰写论文；孙冬霞进行质量控制及审校。

本文无利益冲突。