谢 倩，陈凤宇，周建华，周中高,†

(1.赣南师范大学 a.化学化工学院;b.江西省高校功能材料化学重点实验室；2. 赣南师范高等专科学校 数学系，江西 赣州 341000)

药物杂质的存在是影响药物纯度和功效的主要因素，药物杂质含量较高时，不仅仅大幅度的降低药物活性，还会增加毒副作用，另外还有可能导致药物理化常数、外观性状发生变化，因此药物杂质的确定，特别是结构的准确解析是理解药物性能中非常重要的一个环节. 药物杂质结构的准确解析对药物制备机理和工艺，以及如果规避副反应提供非常直接的参考价值，对药物的药性和副作用的研究也具有极其重要的作用[1-3]. 核磁共振(NMR)技术，特别是氢-氢(1H-1H)和碳-氢(1H-13C)二维相关谱在药物分子分析鉴定和结构归属方面具有举足轻重的位置[4-5]. 药物分子往往具有复杂的化学结构，在核磁共振谱上，化学环境接近的碳氢原子的核磁共振信号也相近，另外化合物的构象差异同样会影响其化学位移. 因此，详尽归属药物杂质的1H和13C NMR数据，不仅需要1H和13C NMR谱图之外，还需要1H-1H和1H-13C二维相关谱的核磁共振数据[6-7].

普卡必利-N-氧化物(prucalopride-N-oxide)是一种二氢苯并呋喃的衍生物，其化学名为4-氨基-5-氯-2,3-二氢-N-[1-(3-甲氧基丙基)-4-哌啶氧基]-7-苯并呋喃甲酰胺(普卡必利-N-氧化物，化合物1)[8-9]，通常被认为是治疗慢性便秘药物普卡必利[10-11]的一种药物杂质.从最近文献报道可知，普卡必利-N-氧化物的制备及其药理研究较少[12-16]；文献也未用二维核磁共振技术详细研究其结构，仅对1H和13C NMR的特征峰进行了简单归属[17-23].本文以4-乙酰氨基-5-氯-2,3-二氢苯并呋喃-7-羧酸甲酯(3)为原料，水解后用酰胺缩合反应，4-氨基-5-氯-2,3-二氢苯并呋喃-7-羧酸(4)直接与1-(3-甲氧基丙基)-4-哌啶胺(5)进行缩合反应得化合物1，对产物进行分离鉴定，发现体系中至少含有化合物1[12-16]、普卡必利(化合物2)、化合物3以及化合物4.本文主要对普卡必利-N-氧化物结构进行分析，先用元素分析(EA)和液相色谱-高分辨质谱(LC-HRMS)对普卡必利-N-氧化物的组成进行成分分析，随后采用一维(1H、13C和DEPT)和二维(1H-1H COSY、1H-13C HSQC和1H-13C HMBC)等多种核磁共振技术开展研究，通过解析上述系列核磁共振谱得到普卡必利-N-氧化物的准确结构，对普卡必利衍生类药物的临床实验具有重要积极作用.

1 实验部分

液相色谱-高分辨质谱(LC-HRMS)是在H-Class/Xevo G2-S QTof型超高效液相色谱/四极杆飞行时间串联质谱仪上进行测试.一维(1H、13C和DEPT)和二维(1H-1H COSY、1H-13C HSQC和1H-13C HMBC)谱图在Bruker Avance III-400型超导NMR谱仪测定，采用PABBO-5 mm多核宽带探头.

参考文献方法[14,16]，制得普卡必利-N-氧化物(prucalopride-N-oxide).1-(3-甲氧基丙基)-4-哌啶胺(99.5%)、4-乙酰氨基-5-氯-2,3-二氢苯并呋喃-7-羧酸甲酯(98.5%)购于上海赢瑞化学科技有限公司，薄层板GF254、硅胶(200-300目)、碳酸钠、氢氧化钠、无水硫酸镁、氯化钠、碳酸氢钠、氯仿、乙醇、四氢呋喃、甲醇等均为国产市售试剂.直径5 mm的NMR样品管(ST-500，NORELL)、DMSO-d6(99.8%)购于青岛腾龙微波科技有限公司.

2 结果与讨论

2.1 普卡必利-N-氧化物的制备与纯化

2.1.1 普卡必利-N-氧化物(1)的分离

N2保护下，将4-氨基-5-氯-2,3-二氢苯并呋喃-7-羧酸(2.0 g，9.36 mmol)和四氢呋喃(30 mL)加入150 mL三口烧瓶中，室温搅拌反应0.5 h，再向其中加入N,N’-羰基二咪唑(2.0 g，12.17 mmol)，继续搅拌反应0.5 h.持续滴加1-(3-甲氧基丙基)-4-哌啶胺(2.08 g，12.16 mmol)的四氢呋喃溶液(20 mL)，保持水浴50 ℃，搅拌反应5 h.停止反应，旋干溶剂，加入50 mL蒸馏水，室温搅拌3 h，过滤，滤饼用水洗(3×20 mL)，其主要成分为普卡必利，柱层析分离得到的其中一种次要组分，即普卡必利-N-氧化物[14,16]，白色固体，真空干燥至恒重，mp 98～99 ℃．元素分析结果：实测值(理论值)(%)：C 56.31 (56.32), H 6.84 (6.83), N 10.94(10.95),C、H、N各元素测试值与计算值比较，两次测定重现性良好.

2.1.2 普卡必利(2)的合成与分离

制备过程与普卡必利-N-氧化物相同，如图1所示，得普卡必利[11,16,21]，白色固体，真空干燥至恒重，mp 90～92 ℃.

图1 合成化合物1和2

2.1.3 4-乙酰氨基-5-氯-2,3-二氢苯并呋喃-7-羧酸甲酯(3)的分离回收

化合物3是制备普卡必利-N-氧化物的过程中添加的一种原料[15]，反应结束后分离回收，结构经过核磁共振表征.1H NMR(400 MHz, DMSO-d6, δ):9.94(s, 1H, NH), 7.64 (s, 1H, Ar-H),4.68(t,J=8.8 Hz,2H,O-CH2),3.80(s,1H,OCH3),3.08(t,J=8.8 Hz,2H,Ar-CH2),2.10(s,1H,OCH3).13C NMR(100 MHz,DMSO-d6,δ):167.91,164.21,160.01,136.34,129.51,120.34,110.78,73.12,52.38,29.76,23.15.

2.1.4 4-氨基-5-氯-2,3-二氢苯并呋喃-7-羧酸(4)的制备与分离

化合物4是制备普卡必利-N-氧化物的过程中的中间原料[15]，向装有搅拌子的500 mL三口烧瓶中加入原料3(26.30 g，9.8 mmol)、甲醇(200 mL)、蒸馏水(150 mL)和现配的氢氧化钠(50%，20 mL)，搅拌，升温至85 ℃，反应6 h，冷却，进一步控制温度在5 ℃，搅拌2 h.蒸去甲醇，过滤，滤饼用蒸馏水洗涤，抽干，转移至500 mL三口烧瓶中，甲醇(100 mL)和蒸馏水(150 mL)，搅拌，升温至85 ℃，待固体全部溶解，滴加浓盐酸(9.0 mL)，控制温度在5至10 ℃，继续反应2 h.析出固体后抽滤，滤饼用蒸馏水(50 mL)洗，抽干，得白色固体4，真空干燥至恒重(17.78 g，85%)，mp253～255 ℃.1H NMR(400 MHz,DMSO-d6,δ):12.02(s,1H,COOH),7.42(s,1H,Ar-H),5.98(s,1H,NH2),4.59(t,J=7.2 Hz,2H,O-CH2),2.96(t,J=8.8 Hz,2H,Ar-CH2).13C NMR(100 MHz,DMSO-d6,δ):166.56,160.69,145.48,130.50,111.85,109.31,102.57,72.44,27.61.

2.2 普卡必利-N-氧化物的液相色谱-高分辨质谱分析

高分辨质谱测试采用正离子检测模式，普卡必利-N-氧化物高分辨质谱图(图2)显示得到m/z=383.161 2的信号峰，普卡必利-N-氧化物(分子式为C18H26ClN3O4)为理论分子量382.160 1，推测图中信号峰为[M+H]+，与理论值一致，符合化合物化学结构.

图2 普卡必利-N-氧化物的高分辨质谱

图3 普卡必利-N-氧化物在DMSO-d6中的1H NMR谱

图4 普卡必利-N-氧化物在DMSO-d6中的13C和DEPT NMR谱

图5 普卡必利-N-氧化物在DMSO-d6中的1H-1H COSY谱(293 K)

2.3 核磁共振谱分析

2.3.1 1D NMR谱图分析

首先以DMSO-d6为溶剂进行1H NMR谱测试，普卡必利-N-氧化物的1H NMR谱(图3)中给出了15组谱峰，结合普卡必利-N-氧化物的化学结构特征，谱峰的化学位移、裂分模式及面积，2,3-二氢苯并呋喃环上的氯原子具有吸电子效应，导致苯环H-6的化学位移向低场移动，δH7.47(s，1H)处的单峰对应苯环H-6；δH3.24(s，3H)可以归属为H-15；由于H-9与酰胺氮相连，因此受去屏蔽效应作用，同时受到H-10a/b的耦合裂分，应为低场的多重峰，故而δH3.90(m，1H)对应H-9；由于2,3-二氢苯并呋喃环特殊化学环境，导致苯并呋喃环上OCH2的化学位移处于相对低场，可将δH4.74(t，J=8.8 Hz，2H)归属为H-2，与参考文献[14,16]中的值相符；其余氢碳原子化学位移准确归属需要进一步借助HSQC和HMBC谱.

从普卡必利-N-氧化物的13C NMR、DEPT45和DEPT135谱图(图4)可以看出，该化合物中含1个伯碳信号峰(δC58.3)、7个仲碳信号峰(δC22.8、27.1、27.7、63.0、68.3、70.4、73.5)、2个叔碳信号峰(δC44.7、128.9)和6个季碳信号峰(δC105.2、110.3、111.3、144.5、157.4、162.9).其中C-15为伯碳，对应δ58.3，C-8为羰基碳，结合其结构特征，化学位移应该处于最低场，对应δ162.9.C-6和C-9为叔碳，δ44.7和δ128.9分别对应C-9和C-6.其余碳原子的精确归属需进一步借助HSQC和HMBC谱[14,16].

2.3.2 2D NMR谱图分析

从普卡必利-N-氧化物的1H-1H COSY谱(图5)可知，H-3是三重峰，与H-2存在相关峰的是2,3-二氢苯并呋喃环上的H-3，结合耦合常数(J=8.4 Hz)，δH3.03(t,J=8.4 Hz，2H)归属为H-3.由于分子内的哌啶环具有一定刚性，导致C-10和C-11上的两个质子不等价(H-10a与H-10b、H-11a与H-11b)，与H-9存在相关峰的是哌啶环上的H-10，δH1.71(m,2H)和δH2.17(m,2H)，归属为H-10a和H-10b.δH3.29(t,J=11.2 Hz，2H)和δH3.01(d,J=10.8 Hz，2H)与H-10存在相关峰，归属为H-11a和H-11b.通过对COSY谱的解析，对普卡必利-N-氧化物大部分质子进行了归属，尚余H-12、H-13、H-14、NH和NH2未归属，需要1H-13C HMBC谱辅助解析.

由普卡必利-N-氧化物的1H-13C HSQC谱(图6)可以看到δC73.5与H-2相关，归属为C-2；δC27.7与H-3相关，归属为C-3；δC128.9与H-6相关，归属为C-6；δC44.7与H-9相关，归属为C-9；δC27.1与H-10a和H-10b均相关，归属为C-10；δC63.0与H-11a和H-11b均相关，归属为C-11；δC58.3与H-15相关，归属为C-15. 尚有3个仲碳(δC22.8、68.3、70.4)和5个季碳(δC105.2、111.3、110.3、144.5、157.4)无法归属，需要1H-13C HMBC谱进一步的辅助解析.

图6 普卡必利-N-氧化物在DMSO-d6中的1H-13C HSQC谱(293 K)

图7 普卡必利-N-氧化物在DMSO-d6中的1H-13C HMBC谱局部(293 K)

C-3a、C-4、C-5、C-7和C-7a尚未归属.结合图7所示的1H-13C HMBC谱，可以发现δ111.3处13C信号峰与NH2、H-2和H-3均有交叉信号峰，可确定为C-3a，δ144.5处信号峰与H-6和H-3存在相关峰，归属为C-4，δ110.3处信号峰与H-6和NH2均有相关峰，归属为C-5，δ105.2处信号峰与H-6存在相关峰，归属为C-7，δ157.4处信号峰与H-2，H-3和H-6均有相关峰，归属为C-7a.

尚余3个仲碳(δC22.8、68.3、70.4)未归属，分别为C-12、C-13和C-14，不难发现C-12直接与杂环N原子相连，C-14直接与甲氧基的O原子相连，两者均受到不同程度的去屏蔽作用，根据化合物结构特征及电子云密度对应的化学位移值，与C-13相比其化学位移处于低场，δC22.8归属为C-13，从HSQC谱上可以看出，δH2.06(m，2H)归属为H-13. 同时从HMBC谱上可以看出，C-14与H-12和H-13均有相关峰；C-12与H-11、H-13和H-14均存在交叉峰，δC68.3归属为C-12，结合HSQC谱，将δH3.17(t,J=8.0 Hz，2H)归属为H-12．结合COSY谱，H-13与H-12，H-13与H-14均有交叉信号峰，结果也验证了上述归属.

通过对普卡必利-N-氧化物一系列一维和二维核磁共振谱(1H、13C、DEPT45、DEPT135、1H-1H COSY、1H-13C HSQC和1H-13C HMBC)的解析，同时结合文献[13,18,22]中的数据，在此，对普卡必利-N-氧化物的1H和13C NMR进行了全部指认，结果详见表1.

表1 普卡必利-N-氧化物的1H和13C NMR归属

*表示文献中未明确归属的氢碳信号**表示文献[14,16]已明确归属的氢碳信号

2.4 普卡必利-N-氧化物和普卡必利的化学位移对比

普卡必利-N-氧化物是在合成普卡必利时获得的次要产物之一，是一种药物杂质，两者结构最大的差别在于其哌啶环结构片段中是否含有N-O(阳、阴离子)基，由于N-O基的存在，N-O基的氧原子存在两对孤电子对，孤电子对的电子云较成键电子对而言，在空间具有更大的伸展，进而容易影响哌啶环的化学环境，改变了化合物1的电子云密度，进而影响附近碳氢原子的1H、13C化学位移．表2是化合物1和化合物2的1H、13C数据，从结果对比可以看出，1H NMR化学位移相差较大的是H-6、H-10、H-11、H-12和H-13，差值分别为148 Hz、56 Hz和72 Hz、340 Hz和184 Hz、300 Hz、112 Hz；13C NMR化学位移相差较大的是C-10、C-11、C-12和C-13，差值分别为610 Hz、1 060 Hz、1 280 Hz和1 800 Hz，化合物1的靠近哌啶环的氢和碳NMR信号均向低场移动，主要是由于N-O(阳、阴离子)基的存在，导致哌啶环的电子云密度降低．相对而言，距离哌啶环较远的2,3-二氢苯并呋喃环因为酰胺键的存在，哌啶环上电子云的变化对2,3-二氢苯并呋喃环的影响较小，与化合物2的相关的1H、13C化学位移相差不大[19].

表2 化合物1和2的1H NMR和13C NMR对比

*表示文献[19]已明确归属的碳氢信号.

3 结论

通过优化合成工艺，分离获得一种重要的药物杂质普卡必利-N-氧化物，综合运用元素分析和液相色谱-高分辨质谱对普卡必利-N-氧化物进行了化学组成分析，借助液体一维和二维核磁共振技术，特别是得益于异核多键相关谱，充分高效地呈现了化合物中1H-13C远程相关耦合的异核信息，结合异核单量子相关谱，以及普卡必利-N-氧化物和普卡必利的结构特点，对两者的1H、13C NMR数据进行对比，揭示了N-O(阳、阴离子)基对屏蔽效应的影响，分析和准确的归属了普卡必利-N-氧化物的1H NMR和13C NMR信号，确定了普卡必利-N-氧化物的化学结构.