白渊翰 杨 曦 曾志文

目前，第一代抗精神病药物(First Generation Antipsychotics, FGAs)由于其严重的椎体外系和心血管系统不良反应，逐渐退居为二线的治疗方案。有趣的是，作为FGAs代表的氟哌啶醇，仍旧活跃在精神分裂症和双相障碍的治疗当中[1, 2]。除了确证的临床疗效外，多项基础研究提示了氟哌啶醇对细胞损伤的保护性作用[3～5]。蛋白激酶B(Protein Kinase B，PKB/Akt)是促进神经发育及细胞存活的一种重要激酶，其编码基因AKT也是精神分裂症的易感基因，Akt激酶在精神分裂症的发病和药物治疗中均发挥了重要作用[6, 7]。前期研究发现氟哌啶醇在体内可以增加Akt激酶活性[7]，而氟哌啶醇是否通过激活Akt激酶并促进细胞存活并不清楚。叉头型转录因子O亚型(Forkhead Box Os，FoxOs)家族中的FoxO1和FoxO3a是Akt激酶的下游靶标，同时也受磷酸肌醇3-激酶(Phosphatidylinositol 3-Kinase，PI3K)的调控。FoxOs作为诱导细胞损伤的关键分子[8]，其在氟哌啶醇细胞保护中的作用也不明确。

PC12细胞来源于成年大白鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤的细胞系，目前作为细胞模型被广泛用于神经细胞存活和凋亡的研究中[9]。研究已证明，当去除培养基中血清时，PC12细胞表现出时间依赖性的凋亡，并且表现出明显的DNA片段破碎的凋亡模式[10]。本研究拟观察氟哌啶醇对血清剥夺PC12细胞的保护性作用，同时采用不同浓度或不同作用时间的氟哌啶醇及特异性的PI3K/Akt信号通路抑制剂预处理研究其在Akt/PI3K-FoxOs信号转导通路中的作用。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂和实验设备 细胞：PC12细胞由加拿大Mcgill University道格拉斯研究中心Remi Quirion教授馈赠提供。试剂：DMEM、胎牛血清(FBS)、马血清(HS)、二联抗生素(PSA)均购自美国GIBCO 公司。氟哌啶醇，LY294002、AktVIII，U0126 均购自美国Sellect公司。设备：双人单面净化超净台(苏州净化设备有限公司)，赛默飞二氧化碳培养箱(美国Thermo公司)，蔡氏倒置荧光显微镜，BioTek Synergy H1多功能酶标仪。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 PC12细胞培养于含有5%FBS、5%HS、1%PSA的DMEM培养基中，于37 ℃、5%CO2条件下培养，待细胞长满后，用含l%FBS、1%PSA的DMEM培养基接种于96孔和6孔板，16 h后对细胞进行处理。

1.2.2 细胞活力测试 血清剥夺实验：将96孔板培养液换成无血清DMEM，孵育1 h后进行处理。7组细胞分别给予含1%FBS的DMEM和不同剂量(0 μm、0.1 μm、0.3 μm、1 μm、3 μm、10 μm)的氟哌啶醇。抑制剂预处理实验：血清剥夺PC12细胞分为6组，其中3组分别给予不处理，1%FBS，1 μm的氟哌啶醇，另外3组分别给予10 μm的LY294002、5 μm的AktVIII、5 μm的U0126处理30 min后，加入浓度为1 μm的氟哌啶醇。MTT法检测细胞活力：上述两个实验中每组细胞设6个复孔，于培养箱中培养24 h后，每孔加入10 μm MTT(10 mg/ml)，再培养3 h，吸去培养液，加DMSO 200 μl/孔，待甲躜结晶完全溶解后，用酶联免疫仪在波长570 nm处读取每孔吸光度(A)。取6孔A值的均数按公式计算细胞存活率=(试验孔A均值/对照孔A均值)× 100%，重复3次。

1.2.3 蛋白提取与Western blot检测 PC12细胞传代并接种于6孔板，于细胞培养箱中培养16 h后，剥夺血清1 h，随后6组细胞加入不同剂量(0 μm、0.1 μm、0.3 μm、1 μm、3 μm、10 μm)的氟哌啶醇处理，30 min后收获蛋白。将同样处理的另外6组血清剥夺PC12细胞中加入1 μm氟哌啶醇，处理不同时间(0 min、8 min、15 min、30 min、60 min、120 min)后收获蛋白。另分5组同样处理的血清剥夺PC12细胞分别给予不处理、氟哌啶醇1 μm、10 μm的LY294002、5 μm的AktVIII、5 μm的U0126。加入抑制剂30 min后3组细胞均接受氟哌啶醇1 μm处理，30 min后收取蛋白。上述三个实验中每组细胞设6个复孔。Western blot实验：向不同实验因素处理的细胞中加入2×Sample Buffer，在冰上摇震裂解细胞约30 min，吸出裂解液，沸水加热8 min使蛋白充分变性，离心冷却后可进行Western免疫印迹。采用SDS-PAGE电泳，每孔加50 μg蛋白样品，90 V电泳分离蛋白，溴酚蓝电泳至分离胶底部时取出分离胶，将其与PVDF膜相贴并排除气泡，两侧夹以滤纸和海绵垫，插入电转槽中60 mA过夜。取出PVDF膜，TBST洗涤，置入含5%脱脂牛奶的TBST中，室温封闭90 min从牛奶中取出，TBST洗膜5 min×3次，加入适当比例稀释的第1抗体4 ℃孵育过夜，次日取出，TBST洗膜5 min×3次，含5%脱脂牛奶的TBST稀释二抗，室温孵育1.5 h，TBST洗膜5 min×3次；配制发光液，在暗房内将发光液均匀滴加到膜上，静置约2 min，出现荧光，根据荧光强度在压片夹中曝光1～30 min不等，显影、定影冲洗出胶片，目的蛋白显示为黑色条带；采用600 dpi分辨率扫描胶片，保存图像数据。

1.2.4 统计学方法 采用SPSS 20.0统计软件进行分析。采用单因素方差分析(ANOVA)分析组间差异，若差异有统计学意义时，进一步组间比较采用LSD-t检验。检验水准α= 0.05，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 氟哌啶醇对血清剥夺PC12细胞存活率影响 与0 μm氟哌啶醇组相比，0.3 μm、1 μm、和3 μm氟哌啶醇能提升细胞存活率(P<0.05)。见图1。与1%FBS组相比，不处理组PC12细胞存活率下降(P<0.05)。与不处理组相比，1 μm的氟哌啶醇能提升细胞存活率(P<0.05)。与1 μm的氟哌啶醇组相比，10 μm的LY294002和5 μm的AktVIII预处理能抑制氟哌啶醇对细胞存活率的提升(P<0.05)。见图2。

注：与0 μm氟哌啶醇组比较，*P<0.05

注：与1%FBS组比较，*P<0.05；与不处理组比较，△P<0.05；与1%FBS组和1 μm的氟哌啶醇组比较，#P<0.05；-代表不予相应处理，+代表给予相应处理

2.2 氟哌啶醇不同浓度和不同作用时间对Akt、FoxOs、ERK蛋白磷酸化水平影响 不同浓度氟哌啶醇作用30 min后，与0 μm氟哌啶醇组相比，0.3 μm和1 μm氟哌啶醇能增加Akt、FoxO1、FoxO3a、ERK蛋白磷酸化水平(P<0.05)；3 μm氟哌啶醇能增加FoxO1、FoxO3a、ERK蛋白磷酸化水平(P<0.05)；10 μm氟哌啶醇能增加ERK蛋白磷酸化水平(P<0.05)。见图3。氟哌啶醇作用15 min和30 min能增加Akt、FoxO1、FoxO3a、ERK蛋白磷酸化水平(P<0.05)；氟哌啶醇作用8 min能增加Akt和ERK蛋白磷酸化水平(P<0.05)；氟哌啶醇作用60 min后能增加FoxO1、FoxO3a蛋白磷酸化水平(P<0.05)。见图4。

注：与0 μm氟哌啶醇组比较，*P<0.05

注：与0 min氟哌啶醇组比较，*P<0.05

2.3 PI3K、Akt、Mek抑制剂对Akt、FoxOs、ERK蛋白磷酸化水平影响 与不处理组相比，1 μm氟哌啶醇能增加Akt、FoxO1、FoxO3a、ERK蛋白磷酸化水平(P<0.05)。与氟哌啶醇组比较，LY294002和AktVIII能减少Akt、FoxO1、FoxO3a蛋白磷酸化水平(P<0.05)。见图5。

注：与不处理组比较，*P<0.05；与氟哌啶醇组比较，△P<0.05;-代表不予相应处理，+代表给予相应处理

3 讨论

本研究采用血清剥夺PC12细胞作为研究神经损伤和保护的细胞模型。血清剥夺可以降低细胞的存活率，氟哌啶醇可以增加血清剥夺PC12细胞的存活率。PI3K/Akt信号通路阻断剂可以阻断氟哌啶醇的保护作用，而Mek通路抑制剂无此作用，这说明氟哌啶醇的保护作用可能是通过PI3K/Akt通路介导的。接着发现氟哌啶醇可增加Akt、FoxO转录因子和ERK激酶的磷酸化水平，这一作用在氟哌啶醇为1 μm和30 min的作用时最为明显，提示中等浓度的氟哌啶醇可能具有较好的神经保护作用，而这种神经保护作用会在一定范围内随时间延长而增加。本研究更进一步发现氟哌啶醇诱导的FoxO转录因子的磷酸化是通过PI3K/Akt激酶介导的。提示氟哌啶醇可以通过磷酸化激活PI3K/Akt通路抑制凋亡因子FoxOs转录因子而产生神经保护作用。

越来越多的研究证据显示，抗精神病药物的治疗作用与Akt激酶相关的细胞内信号相关。小鼠模型经短期和长期氟哌啶醇处理后，脑内Akt1的磷酸化水平明显升高[7, 11]。Beaulieu JM等[12～14]系统地证明了多巴胺D2受体通过beta-arrestin-2调节了Akt的磷酸化。这些结果表明，氟哌啶醇的作用机制可能是由Akt信号通路介导的。同样，精神分裂症患者接受氟哌啶醇治疗后，额叶皮层内源性Akt1激酶的水平有所恢复[11]。

本研究发现氟哌啶醇在0.3～3 μm时具有较好的促细胞存活作用，而10 μm或者更高浓度时能产生细胞毒性和增加细胞的凋亡。先前研究也发现10 μm氟哌啶醇导致培养的大鼠皮层神经元磷酸化Akt显著下降[15]，可以抑制PC12细胞的Akt的磷酸化水平[16]。这两项研究提示，氟哌啶醇对Akt的磷酸化水平的影响在体外培养的神经细胞或相关细胞类型与体内完整的大脑反应似乎不同。培养细胞可能对药物浓度比活体大脑依赖性更敏感-具有明显的浓度依赖性[17]。与这些差异类似，其他研究也证明了体外培养的细胞激活D2受体，如quinpirole或溴隐亭激动剂也可能导致Akt的磷酸化，这表明体外多巴胺介导的Akt磷酸化的确切机制是复杂的[18, 19]，值得进一步研究探讨。

FoxO蛋白家族在细胞发育、增殖、存活和代谢等生命过程中发挥着重要的作用，也是药物研究的一个重要靶点[20]。大量的研究表明，作为PI3K/Akt信号通路的关键下游靶标，FoxO在PI3K/Akt信号通路调控细胞存活的过程中扮演着关键的角色，而且其转录活性直接受PI3K/Akt信号通路的调控[21]。本研究及其他课题组的研究均发现FoxO转录因子在血清剥夺模型和其他多种细胞毒性模型中激活，而锂盐、氯氮平及其他多种神经营养因子均可以抑制FoxO转录因子而产生神经保护作用[9, 22]。本研究发现氟哌啶醇可以增加FoxO1与FoxO3a转录因子的磷酸化，这在很大程度上可以解释氟哌啶醇的神经保护作用机制，而这一作用机制与PI3K/Akt-FoxOs通路而非Mek-ERK通路相关。

综上，血清剥夺诱导PC12细胞损伤是一个经典的神经保护药理学研究细胞模型。本研究发现氟哌啶醇可以通过PI3k/Akt-FoxOs信号通路对PC12细胞产生神经保护作用，而这种作用表现出一定的量效和时效关系。后续研究可以关注氟哌啶醇在模型动物体内是否可以同样影响PI3k/Akt-FoxOs信号通路，进一步探讨该通路与其抗精神病的药理机制之间的关系。