林煌华,谢友坪,马瑞娟,石新国,刘乐冕,陈剑锋

(1.福建省海产品废弃物综合利用工程技术研究中心,福州大学,福建福州 350108; 2.福州市海产品高值化利用行业技术创新中心,福州大学,福建福州 350108)

鳀鱼(Engraulisjaponicus)是一种生活在温带海洋中上层的小型鱼类,多分布在我国东海、黄海和渤海,主要产地在闽浙二省。鳀鱼肉质细嫩且营养价值极高,其中蛋白含量高达15%～20%[1],含有人体需要的各种氨基酸,尤其赖氨酸含量较高[2-3]。鳀鱼的脂肪含量在6%左右,其中二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)含量分别占总鳀鱼油的9.12%和11.89%[4]。此外,鳀鱼还含有多种维生素、微量元素和益生菌[5-6]。鳀鱼常被加工成鱼干、鱼松、鱼片、鱼露、鱼酱油等休闲食品和调味品[7],通过精深加工还可以将其制成鱼油等[8]生物保健品。研究表明,鳀鱼生物制品不但营养丰富,还具有降血糖、调血脂等功效[9-10]。

由于鳀鱼的内源性酶活力较强,鱼体容易变质,在捕捞之后需要尽快加工。蒸煮压榨是鳀鱼加工的关键步骤之一,在蒸煮过程中会有大量蛋白质、游离氨基酸、多肽、风味物质和微量元素等物质溶解在蒸煮液中,使得蒸煮液营养价值极高。但是,由于海上加工技术和空间的限制,目前这些蒸煮液大都被直接排放,造成一定程度的资源浪费[5]。同时,由于蒸煮液的生物耗氧量(BOD)和化学耗氧量(COD)较高,其排放将严重污染海洋生态环境[11]。因此,合理利用鳀鱼蒸煮液对提高海洋资源利用率以及减少环境污染具有重要意义。林云等[12]以鲭鱼罐头蒸煮液为原料,采用生物酶解法获取的生物活性肽能够抑制血管紧张素转化酶(ACE)的活性并具有较高的抗氧化性。有研究报道,通过添加外源蛋白酶从低值鱼中制备多肽,得到的多肽氨基酸组成平衡且必须氨基酸含量高,可用作保健食品的原料[13-15]。杨帆等[16]采用胰蛋白酶酶解制备孔鳐软骨蛋白寡肽,结果显示制备的多肽具有较强的抗氧化性。生物酶解法制备蛋白多肽是目前最有效的手段[17],研究证实,利用复合酶水解蛋白可提高水解度,从而得到更多的小分子多肽[18]。因此,对鳀鱼蒸煮液中的蛋白进行回收,并进一步通过复合酶解法制备生物活性肽,可提高鳀鱼资源的综合利用效率。

本研究以鳀鱼蒸煮液作为原料,旨在通过外源酶酶解技术制备水解肽,在单因素实验的基础上运用中心组合设计法优化复合酶酶解工艺,并对制备获得的水解肽抗氧化活性进行研究,该实验结果可为进一步促进鳀鱼资源的高值化综合利用提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

鳀鱼蒸煮液 福州海汇生物科技实业有限公司;碱性蛋白酶(200000 U/g) 北京索莱宝科技有限公司;胰蛋白酶(50000 U/g) 国药集团化学试剂有限公司;木瓜蛋白酶(800000 U/g) 上海源叶生物科技有限公司;中性蛋白酶(60000 U/g) 北京奥博星生物技术有限责任公司;细胞色素C、抑酞酶、杆菌酶、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸、马尿酸 美国Sigma-Aldrich公司;乙腈、甲醇 色谱纯,国药集团化学试剂有限公司;三氟乙酸、盐酸、氢氧化钠、三氯乙酸 分析纯,国药集团化学试剂有限公司。

UV-1700紫外-可见分光光度计 日本岛津公司;Sartorius BS 210S电子天平 德国Sartorius公司;高效液相色谱仪 日本岛津公司;TGL-15B高速台式离心机 上海安亭科学仪器厂;电热鼓风干燥箱 天津市泰斯特仪器有限公司;循环水式多用真空泵 郑州长城科工贸有限公司;旋转蒸发仪 郑州长城科工贸有限公司;HH-4数显恒温水浴锅 广东深圳国华电器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 鳀鱼蒸煮液制备水解肽的单因素实验 前期实验表明,碱性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶对鳀鱼蒸煮液的酶解效果较好,同时在酶添加量为500 U/g(E/S),蒸煮液蛋白浓度为100 g/L时,酶解效果最佳,基于此,本研究考察不同复合酶组合(碱性蛋白酶+木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶+胰蛋白酶、碱性蛋白酶+中性蛋白酶、木瓜蛋白酶+胰蛋白酶、木瓜蛋白酶+中性蛋白酶、胰蛋白酶+中性蛋白酶)、酶解温度(37.5、47.5、57.5、67.5、77.5 ℃)、酶解pH(4.5、5.5、6.5、7.5、8.5、9.5、10.5)、酶解时间(0、5、15、30、45、60、90 min)、复合酶比例(3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3)对酶解液三氯乙酸氮溶解指数(Trichloroacetic acid-nitrogen soluble index,TCA-NSI值)的影响,确定最适的单因素条件。制备鳀鱼蒸煮液水解肽的酶解单因素实验的基本条件为:底物浓度100 g/L、温度57.5 ℃、酶解时间1 h、pH7.5、复合酶比例1∶1。单因素实验中,改变其中一个因素,固定其他条件,以分析各单因素对TCA-NSI得率的影响。

1.2.2 鳀鱼蒸煮液制备水解肽的响应面试验 在单因素实验基础上,利用Design-Expert 8.0.6,根据Box-Benhnken中心组合设计原理,将温度、pH、复合酶比例(质量比)这3个影响因素作为试验因素,以TCA-NSI为响应值,设计三因素三水平的正交分析试验,试验因素与水平设计见表1。

表1 响应面试验的因素和水平Table 1 Factors and levels of response surface test

1.2.3 TCA-NSI的测定 TCA-NSI为酶解液经过三氯乙酸(TCA)沉淀后的氮溶解指数,可反映蛋白质的酶解效率。TCA-NSI的测定参考郑志强[19]报道的方法。

式(1)

1.2.4 蛋白质浓度测定 蛋白质浓度的测定参照潘风光等[20]的双缩脲法。

1.2.5 多肽分布测定 采用高效液相色谱法进行测定,具体参照GB/T 22729-2008。

1.2.6 鳀鱼蒸煮液蛋白肽的体外抗氧化试验

1.2.6.1 羟自由基清除率的测定 羟自由基清除率的测定参照王爽等[21]的方法,并略作修改。在试管中依次加入0.1 mL不同质量浓度的酶解液、0.4 mL 8.8 mmol/L H2O2、0.4 mL 9 mmol/L FeSO4、0.4 mL 9 mmol/L水杨酸(无水乙醇配制)以及5 mL去离子水,37 ℃反应30 min,于510 nm处测定吸光值A1。未加酶解液的溶液的吸光度以A0表示;以相同体积的蒸馏水代替酶解液设置为空白组,其吸光度以A2表示。以抗坏血酸为阳性对照。

式(2)

1.2.6.2 DPPH自由基清除率的测定 DPPH自由基清除率的测定参考Morales等[22]的方法,并略作修改。在试管中依次加入4.0 mL DPPH乙醇溶液(0.1 mmol/L)和0.2 mL不同浓度的酶解液,混匀。室温静置暗反应30 min,测定517 nm处吸收值A1。以相同体积的乙醇代替样品作为空白组,其吸光值以A0表示。以抗坏血酸为阳性对照。

式(3)

1.2.6.3 超氧阴离子自由基清除率的测定 超氧阴离子自由基清除率的测定参考王艳梅等[23]的邻苯三酚自氧化法,并略作修改。将1.0 mL不同浓度的酶解液与1.8 mL 50 mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.2)混匀,室温静置10 min,加入0.1 mL 10 mmol/L邻苯三酚(溶于10 mmol/L HCl),于320 nm处测定吸光值,每隔30 s读数一次,读数时间为4 min,斜率设定为邻苯三酚自氧化速率(ΔA)。实验组的邻苯三酚自氧化速率以ΔA1表示;以1.0 mL双蒸水代替样品的空白组的邻苯三酚自氧化速率以ΔA0表示。以抗坏血酸为阳性对照。

式(4)

1.3 数据处理

所有实验均重复3次,结果取平均值,实验结果由平均值±SD表示。采用单因素方差分析(one-way ANOVA)的邓肯法(Duncan’s test)分析数据之间的显著性(IBM SPSS Statistics 24.0软件),P<0.05表示数据之间具有显著性差异。采用Origin 8.5软件作图,Design-Expert 8.0软件设计响应面实验。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 蛋白酶的选择 由图1可知,不同复合酶组成(质量比1∶1)对醍鱼蒸煮液的酶解效果具有较为明显的差异。碱性蛋白酶与中性蛋白酶的组合对醍鱼蒸煮液的水解能力最强,TCA-NSI可达73.65%,而木瓜蛋白酶与中性蛋白酶的水解效果最差。由于碱性蛋白酶和中性蛋白酶的催化基团分别是丝氨酸和甘氨酸[24],且鳀鱼蒸煮液中甘氨酸和丝氨酸含量高于其他氨基酸[25],因此碱性蛋白酶和中性蛋白酶的酶解效果优于其他复合酶。综合考虑,选取碱性蛋白酶和中性蛋白酶组成的复合酶进行后续试验。

图1 不同复合酶对TCA-NSI的影响Fig.1 Effect of different complex enzymes on TCA-NSI注:碱:碱性蛋白酶,木:木瓜蛋白酶,胰:胰蛋白酶,中:中性蛋白酶;不同小写字母表示差异显著,图2～图5同。

2.1.2 酶解温度对TCA-NSI的影响 由图2可知,当温度小于57.5 ℃时,随着温度的上升,酶解反应加快,TCA-NSI提高;温度超过57.5 ℃时,TCA-NSI则呈下降趋势。在一定范围内,升温可增加酶的溶解度及酶分子的扩散速度,但过高温度会破坏蛋白酶空间结构,引起不可逆失活。有研究表明该复合酶在54 ℃的条件下酶解绿豆蛋白效果最佳[26],这可能是由于底物的不同造成最适酶解温度存在差异。综合考虑,复合酶的酶解温度应选择57.5 ℃。

图2 酶解温度对TCA-NSI的影响Fig.2 Effect of hydrolysis temperature on TCA-NSI

2.1.3 pH对TCA-NSI的影响 酸碱环境会改变酶的空间构型,影响底物与酶的解离状态,进而影响水解程度。由图3可知,随着pH的升高,TCA-NSI呈现先增后缓慢下降的趋势,在pH为8.5时TCA-NSI最高,为77.55%。有研究表明该复合酶在pH8.5时对绿豆分离蛋白的水解度最高,这与本研究的结果相似[26]。因此,选取pH8.5为最佳酶解pH。

图3 pH对TCA-NSI的影响Fig.3 Effect of pH on TCA-NSI

2.1.4 酶解时间对TCA-NSI影响 由图4可知,在反应初期,随着酶解时间的延长,TCA-NSI迅速增加;当酶解时间超过45 min后TCA-NSI呈现平稳趋势,即TCA-NSI在45、60和90 min无显著性差异(P>0.05)。为节省制备时间,选取45 min为最佳酶解时间。

图4 酶解时间对TCA-NSI的影响Fig.4 Effect of hydrolysis time on TCA-NSI

2.1.5 不同复合酶比例对TCA-NSI的影响 由图5可知,当碱性蛋白酶与中性蛋白酶的比例为2∶1、1∶1和1∶2时TCA-NSI无显著差异(P>0.05),分别是76.25%、73.39%和74.43%,而当比例为1∶3和3∶1时TCA-NSI较低。根据以上结果,可选择复合酶比例为2∶1、1∶1和1∶2进行后续研究。

图5 不同复合酶比例对TCA-NSI的影响Fig.5 Effect of different ratio ofcomplex enzymes on TCA-NSI

2.2 响应面试验结果

2.2.1 响应面试验方案及结果 响应面实验结果如表2所示,利用Design-Expert 8.0.6将相应的TCA-NSI与各因素进行回归拟合后,得到温度(A)、酶解pH(B)、复合酶比例(C)对TCA-NSI的最佳回归方程为:Y=77.63-3.64A-2.54B-3.70C-0.52AB+0.26AC+1.43BC-17.01A2-10.12B2-5.95C2,R2=0.9993。

表2 响应面试验设计与结果Table 2 Design and results of response surface experiment

2.2.2 响应面分析 由图6b、6d、6f可知,在这3组交互作用中,BC(pH和复合酶比例)交互作用最强,其次是AB(温度和pH)的交互作用,而AC(温度和复合酶比例)的交互作用最弱,这与表3显著性检验得到的结果一致。由图6a、6c、6e所示的响应图可知,3个因素与TCA-NSI呈抛物线关系,即随着各因素值的增加,TCA-NSI先增加后减小。

表3 回归方程各项系数的显著性检验和变异数分析Table 3 Significance test and analysis of variance coefficients of regression equation

图6 温度、pH和复合酶比例两两交互对TCA-NSI影响的响应面图和等高线Fig.6 Response surface plots and contour plots of interactive effect of temperature,pH and the ratio of complex enzymes on TCA-NSI

2.2.3 响应面优化结果及回归模型验证 由Design-Expert软件得到酶解鳀鱼蒸煮液的最佳工艺条件为温度54.49 ℃、pH8.18、碱性蛋白酶与中性蛋白酶的比例1.32∶1。为验证模型的可信度,以及考虑实际操作的方便性,对得到的最优工艺进行调整,将验证工艺设计为:温度54.50 ℃、pH为8.20、复合酶比例1∶1,重复验证3次,响应面预测得到的TCA-NSI为78.32%,而验证结果为76.51%,与预测值相近,表明该回归模型能较好地预测鳀鱼蒸煮液的酶解情况。

2.3 酶解液中蛋白肽的分子量测定

从表4可知,鳀鱼蒸煮液中蛋白质的相对分子质量分布主要集中在大于10000 Da的区域(51.046%),而经过酶解后得到由10～40个氨基酸组成的中长肽链(相对分子质量在1500～5000 Da)占10.043%,由2～10个氨基酸组成的小肽链(相对分子质量在180～1500 Da)占81.941%,而游离氨基酸占7.336%。这与顾林等[13]研究利用蛋白酶水解鱼粉蒸煮液得到80%以上的短肽(10肽以下)的结果相似。由此可知,该复合酶可有效将鳀鱼蒸煮液中的大分子量蛋白质水解成小分子多肽,这为通过鳀鱼蒸煮液生产功能性食品提供了理论依据。

表4 酶解液与蒸煮液分子量分布Table 4 Molecular weight distribution ofenzymatic hydrolysate and anchovy cooking liquid

2.4 鳀鱼蒸煮液水解肽的体外抗氧化试验

不同质量浓度的酶解液和抗坏血酸对DPPH自由基、超氧阴离子自由基、羟自由基的清除率随着质量浓度的增大而显著增加,呈现出一定的剂量依赖效应(图7),该结论与石斑鱼肉水解肽的自由基清除能力与溶液浓度呈正相关性的结果一致[27]。计算得到蛋白肽对DPPH自由基、羟自由基、超氧阴离子自由基清除率的IC50分别为(2.45±1.03)、(1.37±1.01)和(3.45±1.01) mg/mL。抗坏血酸对上述自由基的清除率分别为(0.06±0.01)、(0.90±0.02)和(0.39±0.02) mg/mL,说明蛋白肽的抗氧化性弱于抗坏血酸,这可能是因为鳀鱼蒸煮液的酶解产物是混合物,有些多肽的抗氧化性较弱,拮抗作用抑制了活性。但是,一般认为某种物质的IC50低于10 mg/mL时,说明其具有良好的抗氧化性[28]。因此,本研究制备的鳀鱼蒸煮液水解肽具有较强的体外抗氧化活性。

图7 不同浓度水解肽和抗坏血酸对自由基清除率的影响Fig.7 Effect of different concentrations of hydrolyzed peptidesand ascorbic acid on free radical scavenging rate注:(a)羟自由基清除率;(b)DPPH自由基清除率;(c)超氧阴离子自由基清除率。

3 结论

本文优化了复合酶法酶解鳀鱼蒸煮液以获得水解肽的研究方法,并对水解肽的抗氧化活性进行研究。筛选出制备鳀鱼蒸煮液水解肽的较适用复合酶为碱性蛋白酶和中性蛋白酶。复合酶制备鳀鱼蒸煮液水解肽的最佳工艺条件为:酶解时间45 min、酶解温度54.5 ℃、酶解pH8.2、碱性蛋白酶与中性蛋白酶比例1∶1,在此条件下TCA-NSI可达76.51%。鳀鱼蒸煮液水解肽中分子量低于1500 Da的小肽占81.941%,而且水解肽具有较强的体外抗氧化活性。本研究的结果表明采用复合酶法可以高效酶解鳀鱼蒸煮液,酶解产物可用于开发活性肽产品。